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高級病理生理學實驗技術 版權信息
- ISBN：9787030744791
- 條形碼：9787030744791 ; 978-7-03-074479-1
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
高級病理生理學實驗技術 內容簡介
**章、常用心血管疾病實驗動物模型小鼠和大鼠心肌細胞的分離方法和注意事項體外心肌細胞鈣離子成像體外誘導多能干細胞向心肌細胞分化心肌梗死大動物模型構建：--豬心肌梗死模型的構建心肌梗死小動物模型構建-小鼠和大鼠心肌梗死模型的構建小鼠主動脈縮窄模型構建不同程度壓力過載所致心室重構的影響和實驗方法離體心臟Langendorff灌注實驗小鼠心肌再生模型構建第二章、人多能干細胞來源的神經前體細胞的體內移植及鑒定人胚胎干細胞的培養和多能性的鑒定小鼠胚胎成纖維細胞的分離培養和滋養層細胞的制備體外胚胎干細胞向神經細胞的定向分化皮膚細胞體外重編程生成誘導多能干細胞多能干細胞體內畸胎瘤形成實驗小鼠帕金森病模型的構建神經前體細胞的腦內移植、功能鑒定第三章、肝小鼠慢性肝臟纖維化模型的構建第四章、整體腎臟免疫熒光染色及共聚焦3D重建第五章、新冠肺炎病原體棘突糖蛋白和抗體的分析第六章、組織工程皮膚的構建及對皮膚缺損的修復
高級病理生理學實驗技術 目錄
目錄
**章 常用心血管疾病實驗動物模型 1
**節 體外分離心房和心室肌細胞 1
第二節 體外測量心肌收縮和Ca2+瞬變 10
第三節 豬心肌梗死模型：導管介入法 14
第四節 小鼠心肌缺血模型 21
第五節 小鼠主動脈縮窄模型 25
第六節 不同程度壓力過載所致心室重構研究 31
第七節 朗根多夫（Langendorff）灌注法評估大鼠心功能的體外模型 35
第八節 心肌再生小鼠動物模型 39
第二章 人多能干細胞培養、神經定向分化與腦內移植 48
**節 小鼠胚胎成纖維細胞的分離和滋養層細胞的制備 48
第二節 人胚胎干細胞的培養和多能性的鑒定 50
第三節 皮膚成纖維細胞體外重編程生成誘導多能干細胞 53
第四節 基于規律性重復短回文序列簇（CRISPR/Cas9）系統構建人胚胎干細胞基因編輯細胞系 57
第五節 人胚胎干細胞體內畸胎瘤形成實驗 63
第六節 體外人胚胎干細胞向肝細胞的定向分化 67
第七節 體外人胚胎干細胞向心肌細胞的定向分化 70
第八節 體外人胚胎干細胞向神經細胞的定向分化 76
第九節 人源神經前體細胞在小鼠腦內的移植實驗 85
第十節 人源神經前體細胞在小鼠腦內移植的鑒定實驗 88
第三章 小鼠慢性肝臟纖維化模型 93
第四章 整體腎臟免疫熒光染色及共聚焦三維重建 97
第五章 新型冠狀病毒刺突蛋白和抗體的分析 102
第六章 表皮-真皮組織工程化復層皮膚的體外構建 109
參考文獻 113
**章 常用心血管疾病實驗動物模型 1
**節 體外分離心房和心室肌細胞 1
第二節 體外測量心肌收縮和Ca2+瞬變 10
第三節 豬心肌梗死模型：導管介入法 14
第四節 小鼠心肌缺血模型 21
第五節 小鼠主動脈縮窄模型 25
第六節 不同程度壓力過載所致心室重構研究 31
第七節 朗根多夫（Langendorff）灌注法評估大鼠心功能的體外模型 35
第八節 心肌再生小鼠動物模型 39
第二章 人多能干細胞培養、神經定向分化與腦內移植 48
**節 小鼠胚胎成纖維細胞的分離和滋養層細胞的制備 48
第二節 人胚胎干細胞的培養和多能性的鑒定 50
第三節 皮膚成纖維細胞體外重編程生成誘導多能干細胞 53
第四節 基于規律性重復短回文序列簇（CRISPR/Cas9）系統構建人胚胎干細胞基因編輯細胞系 57
第五節 人胚胎干細胞體內畸胎瘤形成實驗 63
第六節 體外人胚胎干細胞向肝細胞的定向分化 67
第七節 體外人胚胎干細胞向心肌細胞的定向分化 70
第八節 體外人胚胎干細胞向神經細胞的定向分化 76
第九節 人源神經前體細胞在小鼠腦內的移植實驗 85
第十節 人源神經前體細胞在小鼠腦內移植的鑒定實驗 88
第三章 小鼠慢性肝臟纖維化模型 93
第四章 整體腎臟免疫熒光染色及共聚焦三維重建 97
第五章 新型冠狀病毒刺突蛋白和抗體的分析 102
第六章 表皮-真皮組織工程化復層皮膚的體外構建 109
參考文獻 113
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高級病理生理學實驗技術 節選
**章常用心血管疾病實驗動物模型 **節體外分離心房和心室肌細胞 摘要 高質量的心肌細胞分離對于在細胞和分子水平上成功研究心肌功能至關重要。 盡管眾多的科研工作己經為不同種類的心肌細胞建立了分離程序，但是要持續得到 存活率高和功能完善的心肌細胞仍然是實驗操作過程中面臨的嚴峻挑戰。朗根多 夫（Langendorff）逆行灌注技術是從完整心臟分離心肌細胞*成功、*易復現的方 法。在本章節中，我們將詳細說明Langendorff分離大鼠心房和心室肌細胞的所有 操作內容。這包括一系列必要的步驟，從快速主動脈插管開始沖洗心臟血液，用不 含鈣離子的溶液短時間灌注心臟，然后用含低鈣離子的酶溶液長時間灌注，以破壞 細胞外基質網絡，提取釋放的心肌細胞并溫和地重新導入鈣離子，使細胞逐漸恢復 到正常的胞質鈣離子水平。通過此方案分離的完整存活心室肌細胞得率約為70%（50%～90%）。通常心房肌細胞得率較心室肌細胞低，約10%。心肌細胞得率還取決 于大鼠的年齡和心臟重塑的程度，因此動物年齡較大或發生重構的心臟（更多纖維化）通常會導致較低的得率。分離的心房和心室肌細胞可用于研究心肌細胞功能（如縮短/收縮、細胞內鈣離子轉化）以及生化和分子生物學研究（如免疫印跡、PCR）。 ―、引言 成功體外分離出成年心肌細胞是在細胞和分子水平上研究和了解心臟生理和病 理機制的重要手段和方法。胚胎心肌細胞和新生心肌細胞的研究不能簡單適用于成 年心肌，因為這些細胞在形態和超微結構以及重要離子通道、鈣調節和收縮蛋白的 表達方面與成年心肌細胞不同。類似的問題也同樣存在于新近發展起來的誘導多能 干細胞衍生而來的心肌細胞。分離的心肌細胞具有不受神經和體液影響的優點，為 高度可控的體外細胞實驗提供了理想的實驗條件。此外，分離心肌細胞提供了從心 臟不同區域（如左心房或右心房、左心室或右心室、梗死病變區域或心臟傳導系統）選擇細胞的可能性。高質量的心肌細胞分離對于新分離和培養細胞的成功研究至關 重要，可以通過多種基因轉染技術干擾靶基因的表達，從而研究靶基因在心肌細胞 功能調控中的作用和分子機制。 從20世紀70年代至今，各種分離心肌細胞的方法逐步發展起來。哺乳動物的 心肌細胞分離可能因物種差異而有所不同。然而，主要的核心分離過程以及獲得功 能完整的、正常鈣運作的心肌細胞所涉及的關鍵因素己經明確。在所有物種中，大 鼠和小鼠可能是分離心肌細胞*常用的動物。Langendorff逆行灌注術是從完整心臟 中分離活心肌細胞的*具重復性和*佳的酶分離技術。這種技術通過主動脈插管對心臟進行灌注，灌注緩沖液在壓力下關閉主動脈瓣，與正常生理血流相反（逆行） 沿升主動脈向下流動，從而充盈冠狀動脈血管。本文介紹的方案描述了從大鼠心臟 分離心房和心室心肌細胞的過程，并對先前發表的實驗方案進行了相應修改。 分離心肌細胞的主要步驟是通過快速主動脈插管進行灌注，使用低鈣溶液清洗 出心臟中的血液，用無鈣的溶液短暫地灌注心臟，使心肌細胞在閏盤處解離，隨后 用含有蛋白水解酶的低鈣溶液長時間灌注，從而降解單個細胞與細胞外基質網絡的 連接，提取解離的心肌細胞并溫和地重新加入鈣，使細胞逐漸恢復到正常的細胞液 鈣離子水平。 在下文中，我們將詳細說明分離大鼠心房和心室心肌細胞的所有步驟，強調成 功制備細胞所需的*關鍵步驟。 二、實驗材料 1.設備 （1）在恒流模式下運行的Langendorff裝置、蠕動泵、水浴箱。 （2）解剖用的光學顯微鏡或放大鏡。 （3）—個大小合適的不銹鋼套管（直徑2～3mm，取決于大鼠的大小）。 （4）外科用絲線（5-0號）、注射器。 （5）剪刀。 （6）鑷子、細彎鋸齒鉗。 （7）300pm篩網、培養皿、蓋玻片、Falcon試管。 2.溶液使用超純水（ddH2O）制備所有溶液，用Milli-QA+超純水系統處理， 強烈推薦使用18.2Q分子生物學等級的水，所有的分離溶液都應該從基本分離緩沖 液中新鮮制備（表1-1）。 （1）基礎分離臺氏液（Tyrode’s solution）（見注意事項1）：130mmol/L NaCl，5.4mmol/L KCl，0.5mmol/L MgCl2，0.33mmol/L NaH2PO4，25mmol/L羥乙基哌嗪乙烷磺酸（HEPES），22mmol/L葡萄糖，0.01U/ml胰島素（pH7.4）。 （2）插管液：含有0.15mmol/LCaCl2和2U/ml肝素的分離臺氏液（見注意事項2）。 （3）心臟停搏液（置冰浴）含有25mmol/LKCl的插管液。 （4）無鈣溶液：含有0.4mmol/L乙二醇雙2-氨基乙醚四乙酸（EGTA）的分離臺 氏液（見注意事項3），10mmol/L2，3-丁二酮肟（BDM）和2U/ml肝素。 （5）酶溶液：含有 0.2mmol/L CaCl2，10mmol/L BDM，0.8mg/ml2型膠原酶，0.05mg/ml XW型蛋白酶的分離臺氏溶液（見注意事項4）。 （6）心房肌細胞停搏液：含有0.2mmol/L CaCl2， 10mmol/LBDM的分離臺氏液。 （7）心室肌細胞停搏液：含0.5mmol/LCaCl2，10mmol/L BDM （見注意事項5），2mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的分離臺氏液。 （8）鈣離子溶液1：含有1mmol/LCaCl2，2mg/mlBSA的分離臺氏液。 （9）鈣離子溶液2：含有1.5mmol/LCaCU的分離臺氏液。 （10）麻醉劑：異氟醚。 （11）層粘連蛋白。 3.動物12～16周齡健康雄性大鼠。 三、實驗方法 1.設置Langendorff裝置 （1）在分離過程中，Langendorff裝置以恒流模式運行。在恒流模式下，心臟的 灌注通過一個蠕動泵來實現，定期檢查蠕動泵的流量，并調整到3ml/min，適當的灌 注對于成功的心肌細胞分離非常重要。 （2）Langendorff系統干凈、無污染的管道和腔室也是非常重要的因素，每次隔 離后，確保徹底清洗Langendorff系統（見注意事項6）。 （3）打開水浴加熱Langendorff系統的套管，使循環灌注液保持在37°C，同時定 期檢查灌注液的溫度。 （4）將所有用于灌注的溶液充氧以維持足夠的O]供應，并防止心臟的缺氧狀態 （見注意事項7）。 （5）向Langendorff裝置中注入含氧的插管溶液，并避免任何氣泡，以防止冠狀動脈氣栓阻塞。 （6）為了有效地將主動脈固定到套管上，需要選用大小合適的不銹鋼套管（直 徑為2mm的套管適用于年輕大鼠實驗和直徑為2.5～3.0mm的套管適用于年齡偏大的大鼠實驗）和適當的5-0外科絲線。 2.心臟切除和插管 （1）準備插管設置（圖1-1），并在注射器中注入含肝素的插管溶液。清除注射 器中的所有氣泡，以防止空氣進入冠狀動脈。 （2）根據當地動物倫理機構批準的方案麻醉和處死大鼠。在我們的方案中，大 鼠用異氟醚麻醉并脫頸處死。 （3）從中腹到橫膈膜切開，用彎曲的鋸齒狀鑷子夾住胸骨，雙側切開。反折胸 腔露出心臟。將肝素溶液（1000U/ml）直接注入心臟（見注意事項8），以防止切除 心臟時血液凝固。 （4）小心地切除周圍的非心臟組織，如肺和結締組織。 （5）用細彎鋸齒鉗輕輕提起心臟，從胸腔取出心臟，放入含氧的低溫心臟停搏 液中，然后輕輕地按壓，初步去除一些心臟血液。 （6）將心臟轉移到裝有含氧冰冷停搏液（見注意事項9）的100mm培養皿中 （圖 1-1）。 （7）在確定主動脈和它的頭顱分支（通常隱藏在胸腺后面）后，切斷它**個分支下面的主動脈，迅速地將心臟滑到主動脈插管上。然后，用手術絲線做一個雙 結扎，以確保扎緊，并將插管液注入心臟（圖1-1）。 （8）將心臟轉移到Langendorff系統（見注意事項10）。 3.心臟灌注和消化 （1）以3ml/min的速率向心臟灌注含氧的無鈣溶液，以清除殘余血液，當心臟停 止跳動時，表明無鈣溶液已經到達心臟。 （2）當無鈣溶液到達心臟時，Langendorff儀器的導管應放置在含氧的酶溶液中。4分鐘后，酶溶液可以到達心臟（見注意事項11）。 （3）以3ml/min的速率向心臟灌注酶溶液，直到心臟出現腫脹、變軟和變蒼白 （見注意事項12，圖1-2）。當用鑷子輕輕地按壓時，心室會變形，心臟就像一個袋 子一樣懸著（圖1-2）。在從心臟表面提取的一滴溶液中，可以發現許多解離的細胞。 心房可能比心室消化得快（約幾分鐘）。當它們變得松軟、蒼白且易于取出時，應將 其取下（見注意事項13）。 4.心房肌細胞的制備 （1）取左心房和右心房，分別放入燒杯中，燒杯中加入0.5ml心房肌細胞停搏液，預熱至37C。 （2）用兩把細鑷子輕輕地解剖心房組織（圖1-3）。然后將燒杯和心房組織放在搖床上，以促進細胞分離。 （3）根據表1-2中的方案，每2分鐘添加一次鈣離子濃度增加的溶液，開始緩慢將鈣離子濃度升高至正常生理濃度（見注意事項14）。 （4）在鈣離子濃度達到正常水平和調整心房肌細胞懸液細胞密度后，將心房肌細胞（圖1-4）種在層粘連蛋白（laminin）涂層的蓋玻片（或培養皿）上，并將細胞 貼在蓋玻片（或培養皿）底部約20分鐘，就可以進行后續實驗了。 （5）心室肌細胞的制備 1）將心室（見注意事項15）放入燒杯中，用約10ml心室肌細胞停搏液預熱至 37C。 2）輕輕地切碎心室（圖1-3，見注意事項16）。 3）通過300pm孔徑的篩布過濾去除未消化組織（圖1-3）。 4）讓細胞在重力作用下（圖1-3，見注意事項17）靜置10分鐘，輕輕吸出上清液。
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