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植物生物技術綜合實驗 版權信息
- ISBN：9787030684172
- 條形碼：9787030684172 ; 978-7-03-068417-2
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>>
植物生物技術綜合實驗 內容簡介
本教材針對教材中的3個模塊: 分子標記技術與基因定位、基因克隆與載體構建、植物組織培養與遺傳轉化, 設計綜合實驗, 以達到加強鞏固理論知識的目的。通過綜合實驗鍛煉學生大局科研思維和實驗技能。本書通過綜合性實驗可以鍛煉學生實踐動手能力、創新性思維能力、獨立分析問題能力及團隊協作能力, 培養學生科學探索精神。
植物生物技術綜合實驗 目錄
目錄
前言
綜合實驗一 突變體的遺傳分析及基因定位 1
實驗一 擬南芥種植、生長發育及雜交 2
實驗二 rrg短根突變體的觀察及遺傳分析 6
實驗三 植物基因組
DNA的提取（CTAB法）和凝膠檢測 10
實驗四 Bulk DNA PCR擴增（SSR技術） 16
實驗五 Bulk DNA PCR擴增產物的PAGE檢測（SSR技術） 21
實驗六 擬南芥F2大群體DNA的PAGE檢測結果分析 25
實驗七 作圖與QTL分析軟件的使用 28
綜合實驗二 植物表達載體的構建 35
實驗八 細菌培養基及其配制 36
實驗九 目標基因引物的設計 38
實驗十 目標基因的PCR擴增 42
實驗十一 載體的選擇和質粒的提取 44
實驗十二 質粒載體的酶切及與PCR產物的連接 49
實驗十三 重組質粒轉化大腸桿菌 53
實驗十四 重組子的篩選及鑒定 56
實驗十五 重組質粒轉化農桿菌 59
綜合實驗三 植物遺傳轉化及轉基因后代的分子檢測 65
實驗十六 植物組織培養培養基的制備 66
實驗十七 棉花愈傷組織的誘導及形態觀察 69
實驗十八 根癌農桿菌介導的植物遺傳轉化 72
實驗十九 植物原生質體的分離和純化 82
實驗二十 轉基因植株PCR陽性檢測 87
實驗二十一 轉基因植株Southern雜交分析 90
實驗二十二 轉基因植株RNA提取及檢測 95
實驗二十三 轉基因材料的RT-PCR檢測 99
實驗二十四 轉基因植株Northern 雜交分析 101
實驗二十五 植物蛋白質的提取與濃度測定 105
實驗二十六 轉基因植株Western雜交分析 109
參考文獻 113
附錄 農桿菌介導水稻遺傳轉化實驗的溶液配方 115
前言
綜合實驗一 突變體的遺傳分析及基因定位 1
實驗一 擬南芥種植、生長發育及雜交 2
實驗二 rrg短根突變體的觀察及遺傳分析 6
實驗三 植物基因組
DNA的提取（CTAB法）和凝膠檢測 10
實驗四 Bulk DNA PCR擴增（SSR技術） 16
實驗五 Bulk DNA PCR擴增產物的PAGE檢測（SSR技術） 21
實驗六 擬南芥F2大群體DNA的PAGE檢測結果分析 25
實驗七 作圖與QTL分析軟件的使用 28
綜合實驗二 植物表達載體的構建 35
實驗八 細菌培養基及其配制 36
實驗九 目標基因引物的設計 38
實驗十 目標基因的PCR擴增 42
實驗十一 載體的選擇和質粒的提取 44
實驗十二 質粒載體的酶切及與PCR產物的連接 49
實驗十三 重組質粒轉化大腸桿菌 53
實驗十四 重組子的篩選及鑒定 56
實驗十五 重組質粒轉化農桿菌 59
綜合實驗三 植物遺傳轉化及轉基因后代的分子檢測 65
實驗十六 植物組織培養培養基的制備 66
實驗十七 棉花愈傷組織的誘導及形態觀察 69
實驗十八 根癌農桿菌介導的植物遺傳轉化 72
實驗十九 植物原生質體的分離和純化 82
實驗二十 轉基因植株PCR陽性檢測 87
實驗二十一 轉基因植株Southern雜交分析 90
實驗二十二 轉基因植株RNA提取及檢測 95
實驗二十三 轉基因材料的RT-PCR檢測 99
實驗二十四 轉基因植株Northern 雜交分析 101
實驗二十五 植物蛋白質的提取與濃度測定 105
實驗二十六 轉基因植株Western雜交分析 109
參考文獻 113
附錄 農桿菌介導水稻遺傳轉化實驗的溶液配方 115
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植物生物技術綜合實驗 節選
綜合實驗一 突變體的遺傳分析及基因定位 一、綜合實驗目的 本綜合實驗以基因克隆的原理與方法為依據，設計 7個分實驗，實驗彼此聯系并且呼應。從擬南芥的種植與雜交開始，依次完成表型、基因型數據的獲取，從而*終定位到突變基因在染色體上的位置。這一綜合性實驗可以幫助學生掌握表型測定、DNA提取、PCR和 PAGE凝膠電泳、數量性狀基因座（QTL）作圖的原理和方法。同時，也可以讓學生從一個整體的角度審視這一綜合實驗，清楚每個實驗間的聯系和實驗目的，從而培養學生的全局觀。 二、綜合實驗原理 1．基因定位的基本原理 基因定位是指利用標記技術將基因定位在某一特定的染色體上，確定基因在染色體上線性排列的順序和位置。利用未知基因與已知標記基因之間的連鎖率 /交換率，將未知基因定位在特定染色體的目標區間內，位于兩個盡量近的標記基因之間。 2．BSA法的基本原理 分離體分組混合分析法又稱混合分組分析法（bulked segregant analysis，BSA法），首先從一對攜帶目標基因且具有表型差異的親本所產生的分離群體中，根據目標基因的表型分別選取一定數量的植株，構成兩個亞群或集團。將每個亞群的 DNA等量混合，形成兩個相對性狀的“基因池”（gene pool），然后用合適的分子標記對兩個基因池進行分析，獲得與目標性狀基因座位連鎖的多態性分子標記。在獲得了與目標基因相連鎖的分子標記以后，可以利用某一作圖群體進行分析以便進一步檢測所得分子標記與目標性狀基因的連鎖程度，以及其在某已知分子圖譜中或染色體上的位置，這樣才能完成真正意義上對基因的標記定位，如下圖所示。由于建池時使用了特定的分離群體，并且在分組時僅對目標性狀進行選擇，這樣可以保證其他性狀的遺傳背景基本相同，兩個基因池之間理論上主要在目標基因區段存在差異，因此兩基因池又被稱為近等基因池，這就排除了環境及人為因素的影響，使研究結果更為準確、可靠。 BSA法克服了很多作物難以得到近等基因系的困難，并且比近等基因系法省時、省力，是一種非常實用的基因標記定位的方法，應用非常廣泛。 三、綜合實驗設計 實驗設計如左圖所示。 實驗一 擬南芥種植、生長發育及雜交 一、實驗目的 1．了解擬南芥生長發育的基本條件和基本生物學特征。 2．通過學習控制光、溫等條件來培養模式植物擬南芥。 3．掌握擬南芥的種植方法及雜交的過程與方法。 二、實驗原理 擬南芥（ Arabidopsis thaliana）屬被子植物門雙子葉植物綱十字花科植物，擬南芥基因組大約有 12 500萬堿基對和 5對染色體。擬南芥的優點是植株小、結子多，為自花授粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型植株。因此，擬南芥是進行遺傳學研究的好材料，被科學家譽為“植物中的果蠅”。 1． 播種和發芽 將播有種子的容器移至相應低溫條件下，在 2～4℃下放置 2～4 d，從而在吸脹條件下破除種子休眠，這對新鮮收獲的擬南芥種子來說尤為必要。大多數擬南芥品系的種子是中度休眠的，收獲已久的這類生態型的擬南芥種子可免于低溫處理，而有些生態型甚至需長達7 d 的低溫處理。干種子的低溫處理往往是無效的。低溫處理后，將容器移至溫室或生長室，在22℃左右培養發芽，夜溫可比日溫低2℃，用2000 lx 的熒光燈給予光照，光周期為8 h 光/6 h 暗（也可24 h 光照），在5 d 左右可見擬南芥發芽。擬南芥發芽需光，故應防止種子被土覆蓋。 2．生長發育條件的控制 擬南芥一般是冬性一年生植物，自然條件下種子在秋天發芽，幼年期在冬天度過，花分生組織在春季分化，種子在夏季成熟脫落。大多數實驗室栽植的擬南芥品種在發芽4 周后開花，而在開花后4～6 周內采集種子。不同生態型擬南芥的發育進程、開花時間、成熟時間等除了取決于遺傳性以外，也受外界環境條件的影響。 1）光 光對擬南芥生長的影響涉及光強度和光周期兩個方面。從光強度方面來說，在生長室中一般*適合的光強度為120～150 μmol/（m2 s），這可通過熒光燈配以白熾光來達到。在夏天溫室中，60% 遮陰有助于光強控制和溫度調節，較老植株可以忍受高光強或直接太陽光照射，而年幼植株則應避免強光。 擬南芥在連續照光和長日照下開花速度加快，短日照時開花過程被阻遏或延遲，這表明擬南芥開花需要長日照，光周期一般為12 h 光/12 h 暗。冬季在溫室中可補充早晚的光照，以滿足光周期需要，一般以16 h 光照、8 h 暗期為宜。連續光照可促進生殖生長，略微提早開花，但使葉數減少及種子生成量降低，而較短日照有利于營養生長。 2）溫度 擬南芥的*適生長溫度為25℃，稍低的溫度也是允許的。當水分供應充足時，植物甚至能在溫度高達34℃時生長，但會減少受精。雖然較老的植株能忍受高溫，但保持25℃對整個植株生長周期是有利的。當種子形成時，生長室溫度宜設定在25℃，夜溫比日溫低2～4℃為宜。 對于許多遲開花的擬南芥生態型來說，幼苗期要在4℃左右處理一個時期（如幾周），以完成春化作用，從而在長日照下促進開花。而對于常用的擬南芥生態型，如Landsberg erecta（Ler）和Columbia 則不需春化處理就能開花。必須注意這里的低溫春化處理不同于播種時破除休眠的低溫處理，破除休眠的低溫處理又稱層積處理（stratification）。 3）水分 在種子發芽后的頭幾周里，理想的供水是來自土壤毛細管由下至上的滲水，只有當土壤呈現干旱時才適時灌水。過量供水會引起土表藻類和真菌的生長。在擬南芥頭兩片真葉開始伸展之前必須避免干旱，當真葉長出后，灌水頻率可相應減少，如每周一或兩次。而在角果充實階段必須保證水分供應，以利于種子形成。在角果成熟階段澆水時*好待90% 左右的穴盤或花盆干燥之后進行。土壤供水狀況會影響擬南芥的生長發育。濕度的增加（如 50%～60%）會大大減少土表干旱的影響以及發芽幼苗脫水的危害，但一般來說，擬南芥植株包括幼苗都能忍受低濕度。處在蓮座狀階段的植株可在不同濕度下生長，當長角果進入成熟階段時，較低濕度（如＜50%）是有利的。 4）營養 正常情況下無須供給營養物質，但是貧瘠的營養狀況會降低植株高度，使它提早開花，并使種子著生減少。在生長發育的后期階段補充營養物質會促進種子著生，并產生較健壯的植株。當植株呈現出輕微淡綠色時，表明營養供給不足，應立即施以營養物質，正常健壯的擬南芥植株是亮暗綠色的。 5）防止雜交 擬南芥是自花授粉植物，為了保持擬南芥品系的純化，必須防止溫室或生長室中各品系之間的雜交。為此可根據各自實驗室條件進行設置，如保持生長環境的清潔，從而切斷經昆蟲媒介而導致的雜交途徑。栽植時注意各品系之間的種植距離（如 20 cm），從而防止不同品系的花互相接觸。在長成植株后，可采取適當措施，防止植株倒伏，避免互相接觸。 因此，人為恰當地調節光照和溫度等條件是很好地控制擬南芥生長發育的關鍵。低溫和長日照都有利于擬南芥的開花。如果希望擬南芥具有良好的營養體，則可通過適當縮短光照時間來實現；如果想使擬南芥的生育期提前，可以通過適當密植或延長光照時間來實現。 三、材料與用品 1．實驗材料 Ler生態型擬南芥種子（野生型）、rrg短根突變型擬南芥種子（突變型）。 2．實驗器具 小濾紙條、鑷子、蛭石、田園土、一次性塑料杯子、雜交袋、托盤、光照培養箱等。 四、實驗步驟 1．擬南芥的種植 （1）將蛭石和田園土按 1∶1混合，裝入底部戳 4或 5個小孔的一次性塑料杯子內。 （2）將上述準備的盛有混合土的杯子放到托盤中。 （3）取小濾紙條對折并撮少許 Ler生態型擬南芥種子和 rrg短根突變型擬南芥種子，然后均勻地撒在沙土的表面，每種種子各自種一杯。 （4）待所有的種子都播種完成之后，用自來水澆灌直到一次性杯子內沙土的上表面完全被水浸濕為止。 （5）將播種并澆灌完成的一次性杯子連同托盤一起放到光照培養箱內，培養箱的溫度設置為22℃，光照時間為每天12 h。 （6）適時澆水、觀察（圖1-1）。 圖1-1 擬南芥的生育期 A．1 周2 片真葉幼苗；B．2 周4 片真葉幼苗；C．3 周8 片真葉幼苗；D．4 周抽薹前期幼苗；E．5 周抽薹期成株；F．盛花期成株；G．花；H．花絮；I．種子 2．擬南芥的有性雜交 （1）選擇母本：選擇剛剛能看見一點白色花苞的擬南芥作為母本。 （2）去雄：用消毒好的鑷子小心去掉母本花的花萼（綠色部分），隨后去掉花瓣（白色部分），*后去掉雄蕊（呈微黃色）。 （3）選擇父本：選擇花完全展開，呈十字狀，雄蕊花藥完全成熟（花藥很黃，裂開有花粉）的擬南芥作為父本。 （4）人工授粉：用鑷子夾住雄蕊柄部取下，在去雄后的母本花柱頭上輕輕擦拭數次，套好雜交袋，并做好標記（包括父本、母本、雜交日期等）。注意：授粉*好在上午10 點之前進行；母本花去雄后1～2 d 授粉皆可。 （5）觀察記錄：2～3 d 后，如果柱頭正在發育膨大，則表明雜交成功（圖1-2）。 五、注意事項 1．選擇母本時，一定要選用花苞適中的花朵作為母本。花苞過小，可能無法授粉，也不便于后續操作；花苞過大，可能已經散粉而無法進行雜交。 2．母本去雄時，操作過程不要弄傷、弄折柱頭及花莖，否則花將無法正常授粉、發育，*終無法得到雜交種子。 圖 1-2 擬南芥雜交過程示意圖粉、發育，*終無法得到雜交種子。 3．選擇父本時，盡量選擇較大、已經散粉但閉合的花苞，避免外界花粉的干擾而形成不知親本來源的雜交后代。 六、實驗結果與分析 1．記錄出芽時間、長出真葉時間以及開花的時間。 2．統計雜交的成功率。 七、思考題 如果想使擬南芥盡快開花，如何調節培養條件？ 實驗二 rrg短根突變體的觀察及遺傳分析 一、實驗目的 1．進行相對性狀的觀察，掌握判斷顯性性狀和隱性性狀的方法。 2．掌握質量性狀的遺傳分析方法和基本原理。 3．掌握擬南芥無菌苗的種植方法。 二、實驗原理 1．顯隱性的判定 兩親本雜交得到 F1后代，通過觀察親本、 F1植株的表型來判定性狀的顯隱性。本實驗中， rrg突變體表現為短根表型，野生型表現為正常根表型。若 F1植株表現為正常根表型，則突變為隱性突變；若 F1植株表現為突變短根表型，則突變為顯性突變。
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