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生物化學實驗教程 版權信息
- ISBN：9787030732842
- 條形碼：9787030732842 ; 978-7-03-073284-2
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
生物化學實驗教程 內容簡介
《生物化學實驗教程》（第四版）在第三版的基礎上增加了熒光分析蛋白質構象變化、分子伴侶輔助蛋白質復性和NanoDrop分析DNA增色效應等實驗內容！渡锘瘜W實驗教程（第四版）》共分為三部分：**部分為基礎性實驗，介紹生物化學實驗的基本原理和技術。第二部分為綜合性實驗，主要介紹蛋白質的純化鑒定及部分分子生物學實驗技術。以上兩部分實驗包含了層析、紫外 可見分光光度、熒光分光光度、電泳、離心分離和生物發光等技術，涉及蛋白質、核酸、維生素、糖、脂和激素的分離、制備、定性和定量分析，以及生物大分子的結構和功能分析。第三部分為研究性實驗，實驗用時略長，以培養學生獨立科研能力為主要目的。
生物化學實驗教程 目錄
目錄
**部分基礎性實驗
實驗1氨基酸的分離鑒定——紙層析法(2)
實驗2凝膠層析法使蛋白質脫鹽(4)
實驗3蛋白質的沉淀與透析(7)
實驗4膜分離技術——離心超濾法純化和濃縮蛋白質(11)
實驗5微量凱氏（Micro-Kjeldahl）定氮法測定蛋白質含量(13)
實驗6利用分光光度計測定雙縮脲反應的有色產物吸收光譜(18)
實驗7BCA法測定蛋白質含量(20)
實驗8考馬斯亮藍法測定蛋白質含量(22)
實驗9紫外吸收法測定蛋白質含量(25)
實驗10乙酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白(27)
實驗11聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳分離血清蛋白(31)
實驗12利用蛋白質內源熒光分析蛋白質構象變化(35)
實驗13分子伴侶對變性螢火蟲螢光素酶復性的影響(38)
實驗14酶的特異性(41)
實驗15酶促反應動力學(43)
實驗16琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制(48)
實驗17脲酶Km值的測定(50)
實驗18過氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳分離及鑒定(54)
實驗19酵母RNA的提取與組分鑒定(57)
實驗20動物肝臟DNA的提取與檢測(60)
實驗21RNA定量測定——改良苔黑酚法(63)
實驗22核酸的定量測定——紫外分光光度法(66)
實驗23乙酸纖維素薄膜電泳分離核苷酸(68)
實驗24NanoDrop分析DNA增色效應(71)
實驗25維生素C的定量測定——2，6二氯酚靛酚滴定法(74)
實驗26還原糖含量的測定——3，5二硝基水楊酸（DNS）比色法(77)
實驗27血糖含量的測定——GODPAP法(79)
實驗28植物組織中可溶性糖含量的測定——蒽酮法(81)
實驗29飽食、饑餓、腎上腺素、胰島素對肝糖原含量的影響(84)
實驗30小麥萌發前后淀粉酶活力的比較(86)
實驗31脂肪酸的β氧化(89)
實驗32血清中谷丙轉氨酶活性的測定(92)
實驗33生物發光法測定ATP濃度(95)
第二部分綜合性實驗
實驗34細胞色素c的提取制備與含量測定(100)
實驗35凝膠層析法測定蛋白質相對分子質量(104)
實驗36質粒的提取、酶切與電泳分析(108)
實驗37聚合酶鏈反應(113)
實驗38蛋白質印跡法（Western-Blotting）(116)
第三部分研究性實驗
實驗39轉基因植物的PCR鑒定(126)
實驗40植物熱激蛋白的蛋白質印跡分析(127)
實驗41閱讀框影響融合蛋白表達正確性(128)
附錄一實驗報告范例(130)
附錄二生物化學實驗常用參考數據(136)
主要參考文獻(145)
**部分基礎性實驗
實驗1氨基酸的分離鑒定——紙層析法(2)
實驗2凝膠層析法使蛋白質脫鹽(4)
實驗3蛋白質的沉淀與透析(7)
實驗4膜分離技術——離心超濾法純化和濃縮蛋白質(11)
實驗5微量凱氏（Micro-Kjeldahl）定氮法測定蛋白質含量(13)
實驗6利用分光光度計測定雙縮脲反應的有色產物吸收光譜(18)
實驗7BCA法測定蛋白質含量(20)
實驗8考馬斯亮藍法測定蛋白質含量(22)
實驗9紫外吸收法測定蛋白質含量(25)
實驗10乙酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白(27)
實驗11聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳分離血清蛋白(31)
實驗12利用蛋白質內源熒光分析蛋白質構象變化(35)
實驗13分子伴侶對變性螢火蟲螢光素酶復性的影響(38)
實驗14酶的特異性(41)
實驗15酶促反應動力學(43)
實驗16琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制(48)
實驗17脲酶Km值的測定(50)
實驗18過氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳分離及鑒定(54)
實驗19酵母RNA的提取與組分鑒定(57)
實驗20動物肝臟DNA的提取與檢測(60)
實驗21RNA定量測定——改良苔黑酚法(63)
實驗22核酸的定量測定——紫外分光光度法(66)
實驗23乙酸纖維素薄膜電泳分離核苷酸(68)
實驗24NanoDrop分析DNA增色效應(71)
實驗25維生素C的定量測定——2，6二氯酚靛酚滴定法(74)
實驗26還原糖含量的測定——3，5二硝基水楊酸（DNS）比色法(77)
實驗27血糖含量的測定——GODPAP法(79)
實驗28植物組織中可溶性糖含量的測定——蒽酮法(81)
實驗29飽食、饑餓、腎上腺素、胰島素對肝糖原含量的影響(84)
實驗30小麥萌發前后淀粉酶活力的比較(86)
實驗31脂肪酸的β氧化(89)
實驗32血清中谷丙轉氨酶活性的測定(92)
實驗33生物發光法測定ATP濃度(95)
第二部分綜合性實驗
實驗34細胞色素c的提取制備與含量測定(100)
實驗35凝膠層析法測定蛋白質相對分子質量(104)
實驗36質粒的提取、酶切與電泳分析(108)
實驗37聚合酶鏈反應(113)
實驗38蛋白質印跡法（Western-Blotting）(116)
第三部分研究性實驗
實驗39轉基因植物的PCR鑒定(126)
實驗40植物熱激蛋白的蛋白質印跡分析(127)
實驗41閱讀框影響融合蛋白表達正確性(128)
附錄一實驗報告范例(130)
附錄二生物化學實驗常用參考數據(136)
主要參考文獻(145)
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生物化學實驗教程 節選
**部分基礎性實驗 實驗1氨基酸的分離鑒定——紙層析法 【實驗目的】 1. 學習氨基酸紙層析法的基本原理。 2. 掌握氨基酸紙層析法的操作技術。 【實驗原理】 紙層析法（paper chromatography）是生物化學上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術，可用于蛋白質氨基酸成分的定性鑒定和定量測定，也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機酸、維生素、抗生素等物質的一種分離分析工具。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機溶劑是流動相。在層析時，將樣品點在距濾紙一端2～3cm的某一處，該點稱為原點；然后在密閉容器中層析溶劑沿濾紙的一個方向進行展層，這樣混合氨基酸在兩相中不斷分配，由于分配系數（Kd）不同，結果它們分布在濾紙的不同位置上。物質被分離后，在紙層析圖譜上的位置可用比移值（rate of flow， Rf）來表示。所謂Rf，是指在紙層析中，從原點至氨基酸停留點（又稱為層析點）中心的距離（X）與原點至溶劑前沿的距離（Y）的比值： 在一定條件下某種物質的Rf值是常數。Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、溫度、濕度、層析濾紙的型號和質量等因素有關。 【器材與試劑】 1. 器材 層析缸（或標本缸）、點樣毛細管（或棉棒）、小燒杯、培養皿、量筒、喉頭噴霧器、吹風機（或烘箱）、層析濾紙（新華一號）、直尺及鉛筆。 2. 試劑 （1） 擴展劑（水飽和的正丁醇和乙酸混合液)： 將正丁醇、乙酸和水以體積比4∶1∶1混合，充分振蕩。 （2） 氨基酸溶液： 0.5%（m/V)組氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它們的混合液（各組分均為0.5%）。 （3） 顯色劑： 0.1%（m/V)水合茚三酮正丁醇溶液。 【實驗步驟】 圖1-1紙層析中的RfRf=XY 1. 準備濾紙 取層析濾紙（長18cm、寬15cm）一張，在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆畫一條直線（圖11），在此直線上做5個等距離點。 2. 點樣 用毛細管將各氨基酸樣品分別點在這5個位置上，干后重復點樣2～3次。每點在紙上擴散的直徑不超過3mm。 3. 擴展 用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20mL擴展劑的培養皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1cm）。待溶劑上升10～12cm時即取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風機冷風吹干。 4. 顯色 用噴霧器均勻噴上0.1%水合茚三酮正丁醇溶液，然后用吹風機熱風吹干或者置烘箱中（100℃）烘烤5min即可顯出各層析斑點。 5. 計算 用直尺測量并計算出各標準氨基酸的Rf值，同時計算出混合氨基酸的四個層析斑點的Rf值。通過與標準氨基酸比較，確定混合氨基酸中各氨基酸在濾紙上的位置。 【要點提示】 1. 取濾紙前，要將手洗凈，因為手上的汗漬會污染濾紙，并盡可能少接觸濾紙，如條件許可，也可戴上一次性手套拿濾紙。要將濾紙平放在潔凈的紙上，不可放在實驗臺上，以防止污染。 2. 原點不宜太大，直徑應小于3mm，否則分離效果不好，并且樣品用量大，會造成“拖尾”現象。 3. 在濾紙的一端用點樣器點上樣品，原點要高于培養皿中擴展劑液面約1cm。由于各氨基酸在流動相（有機溶劑）和固定相（濾紙吸附的水）的分配系數不同，當擴展劑從濾紙一端向另一端展開時，對樣品中各組分進行了連續的抽提，從而使混合物中的各組分分離。 【思考題】 1. 紙層析法的原理是什么？ 2. 何謂Rf？影響Rf的主要因素是什么？ 實驗2凝膠層析法使蛋白質脫鹽 【實驗目的】 學習凝膠層析法分離純化物質的原理與操作技術。 【實驗原理】 凝膠層析也稱凝膠過濾，其分離純化物質的原理是: 凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質被排阻在外部，當一混合溶液通過凝膠層析柱時，溶液中的物質就按不同相對分子質量被分開了。凝膠層析過程中一般不變換洗脫液，具有設備簡單、操作方便、重復性好和樣品回收率高等優點。所以，此法除了常用于分離純化蛋白質（包括酶類）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物質外，還可用于測定蛋白質的分子質量、樣品的濃縮和脫鹽等方面。目前常用的凝膠包括葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠，其中*常用的是葡聚糖凝膠。 葡聚糖凝膠的商品名稱為Sephadex，它是葡萄糖通過α1，6糖苷鍵形成的葡聚糖長鏈，與交聯劑環氧氯丙烷以醚鍵相互交聯而成的，具有三維空間的多孔網狀結構物（圖12），呈珠狀顆粒。 圖1-2葡聚糖凝膠的多孔網狀結構示意圖 在合成凝膠時，控制環氧氯丙烷的用量，可以制成網孔大小不同的葡聚糖凝膠，即不同規格的凝膠。葡聚糖凝膠從G10到G200有多種類型。G后的數字代表每克干膠充分溶脹后吸水的克數乘以10，也反映了凝膠網孔的相對大小，G后的數字越小，其溶脹后的網孔越小。一般G10到G50適用于蛋白質與小分子或無機鹽的分離，G75到G200適用于相對分子質量大于10000Da的蛋白質的相互分離。 蛋白質溶液中如含有無機鹽離子，用葡聚糖凝膠層析法可使蛋白質與無機鹽分離，效果理想。本實驗用G25凝膠使蛋白質與（NH4)2SO4分離，當蛋白質的鹽溶液進入葡聚糖凝膠時，小分子的（NH4)2SO4擴散進入G25的網孔中，而大分子的蛋白質因顆粒直徑大，不能進入網孔中，被排阻在凝膠顆粒（固定相）的外面。加入洗脫液（流動相）洗脫時，因大分子的蛋白質從凝膠顆粒的間隙隨洗脫液向下流動，首先被洗脫下來，而小分子的（NH4)2SO４可以擴散進凝膠顆粒的網孔之中，在層析柱中移動較慢，需要較大的洗脫體積才能從柱中洗出，這樣蛋白質與（NH4)2SO4很容易地被分離開，從而達到使蛋白質樣品脫鹽的目的（圖13）。 圖1-3凝膠層析法原理示意圖 （a) 蛋白質混合物上柱； （b) 樣品上柱后，小分子進入網孔，大分子不能進入，故先洗脫下來； （c) 小分子后洗脫下來 【器材與試劑】 1. 器材 鐵架臺、層析柱（11mm×300mm）、滴定管夾、1mL刻度滴管、刻度試管、白瓷板、Sephadex G25（粒度粗50～100目）、細乳膠管、螺旋夾、彈簧夾、燒杯。 2. 試劑 （1) 10％（m/V)磺基水楊酸溶液。 （2） 奈斯勒（Nessler）試劑： 通常稱為奈氏試劑，將HgI2 11.5g、KI 8g溶于去離子水中，稀釋至50mL，加入6mol/Ｌ NaOH 50mL，靜止后取上清液儲存于棕色瓶中。 （3） 蛋白質（NH4)2SO4溶液： 實驗前配制含0.25％（m/V)牛血清清蛋白、0.1％（m/V)（NH4)2SO4和10%（m/V)蔗糖的混合溶液。 （4） 去離子水（洗脫液）。 【實驗步驟】 1. 溶脹凝膠 用去離子水浸泡Sephadex G25 24h以上（中間換一次水），或用去離子水沸水浴溶脹2h左右。 2. 凝膠裝柱 將層析柱固定在鐵架臺上，兩端分別連接乳膠管。上端與洗脫液連通，裝一螺旋夾用于調控洗脫速度。先用少量洗脫液洗柱并排出乳膠管中的氣泡，待柱中洗脫液高度約2cm時，關閉下端開關式彈簧夾。 將溶脹好的Sephadex G25倒入層析柱中，使其自然沉降，沉降后凝膠柱的高度為層析柱的3/4～4/5且柱床面平整度比較理想。打開下端開口，排除多余的洗脫液，床面上維持約2cm高的洗脫液，再關閉下口。 3. 洗柱 通過細乳膠管小心地將燒杯中的洗脫液與層析柱接通，然后打開下端開口，讓洗脫液滴下沖洗層析柱，以除去雜質并使柱床均勻密實（此步也稱作平衡）。適當時間后（流下的洗脫液體積一般為柱床體積的2～3倍），再關閉下口。洗柱過程中注意調整流速約2mL/min。 4. 加樣洗脫 用刻度滴管吸取1mL樣品［蛋白質（NH4)2SO4溶液］，其尖頭小心沿層析柱內壁伸到床面之上，慢慢將樣品加到凝膠床面上（不可攪動床面），此時能看到床面上樣品與洗脫液之間有一清晰界面。打開下端開口，待樣品全部進入凝膠柱中，接通洗脫液，開始洗脫并收集洗脫液。
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