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分子生物學細胞生物學實驗實戰技巧 版權信息
- ISBN：9787504698902
- 條形碼：9787504698902 ; 978-7-5046-9890-2
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
分子生物學細胞生物學實驗實戰技巧 內容簡介
在研發抗體展示平臺的過程中，特別是在與學生一起工作的過程中，著者深刻體會到實驗技巧對實驗成功的重要性。許多時候，實驗進展緩慢并不是因為實驗設計或實驗思路不對，而是因為實驗方法不對、實驗技巧欠缺或實驗結果的分析方法不對。這不但影響研發的進展，也影響學生和科研新手的科研興趣，甚至可能影響職業選擇和職業發展。為解決這個困難，作者撰寫了該書。
分子生物學細胞生物學實驗實戰技巧 目錄
目?? 錄
引言 001
**章?? 建立哺乳動物細胞表面抗體展示技術平臺 002
**節?? 多樣化的抗體篩選技術 002
一、雜交瘤技術 004
二、B 淋巴細胞單克隆技術 005
三、細胞表面抗體展示技術 005
四、哺乳動物細胞表面全長抗體展示技術 006
第二節?? 全長抗體在哺乳動物細胞表面的展示和分析 008
一、單基因表達系統的選擇 008
二、分泌型全長抗體的表達和分析 009
三、展示型全長抗體的表達和分析 012
四、抗原與展示型抗體的結合具有劑量依賴性 026
第三節?? 同步表達展示型和分泌型抗體 028
一、FCS（Furin 切割序列） 028
二、表達載體的設計和構建 029
三、抗體表達細胞 030
四、展示型抗體的分析 032
五、分泌型抗體的分析 033
第二章?? 哺乳動物細胞表面抗體展示技術平臺的應用 038
**節?? 篩選抗原特異性抗體 038
第二節?? 分析不同抗體的表達強度 040
一、抗體的選擇 040
二、具體的實驗和分析過程 040
第三節?? 篩選高親和力抗體 045
第四節?? 分析鑒定中和抗體 054
第三章?? 應用哺乳動物細胞表面抗體展示技術優化抗體親和力 058
**節?? 隨機突變展示型抗體基因庫的構建及分析 058
一、抗體及突變位點的選擇 058
二、突變方案及引物設計 060
三、抗體基因庫的構建及分析 060
第二節?? 細胞水平抗體庫的構建及高中和活性抗體的篩選 063
一、細胞庫的構建及分析 063
二、陽性抗體克隆的分選與分析 064
三、陽性抗體突變位點氨基酸的變化與中和活性的提高 065
第四章?? 展示型全長人源一級抗體庫的構建及分析 067
**節?? 表達載體的構建 068
一、啟動子的選擇 068
二、限制性內切酶的選擇 068
第二節?? 抗體基因庫的擴增 078
一、基本思路 078
二、設計合成擴增引物 080
三、外周血淋巴細胞總 RNA 提取 084
四、基因庫 cDNA **鏈的合成 085
第三節?? 抗體庫的常規構建 091
第四節?? 抗體庫的快速構建 100
人源抗體重鏈可變區和全長輕鏈基因擴增引物的分組 100
第五章?? 定向快速高效多片段分子克隆與二級抗體庫的構建 114
**節?? 需求與可行性 114
第二節?? 雙表達載體的設計與構建 116
一、雙表達載體需要的功能組分 116
二、雙表達載體的設計 117
三、引物的設計及 DNA 片段的 PCR 合成 118
四、4 片段定向連接構建雙表達載體 119
五、分析雙表達載體的抗體表達功能 120
六、4 個片段的自我連接與定向連接分析 121
七、4 片段定向連接效率分析 123
第三節?? 用 4 片段定向連接快速高效構建二級抗體庫 124
第六章?? 乙型肝炎病毒表面抗原特異性抗體的篩選 126
**節?? 從抗體庫篩選特異性抗體的思路 126
一、一級抗體庫的特點及篩選難度 126
二、二級抗體庫與定點整合系統的局限性 127
三、從細胞展示抗體庫中篩選特異性抗體的設想 128
四、從定點整合二級免疫抗體庫開始是一個可行的方案 129
第二節?? 乙型肝炎特異性一級庫的構建及分析 129
一、為什么選擇篩選乙型肝炎病毒表面抗原特異性抗體 129
二、PBMC 的需求及總 RNA 的提取 131
三、一級抗體庫的庫容及質量分析 131
第三節?? 雙表達定點整合乙型肝炎特異性抗體庫的構建及分析 134
一、載體水平定點整合乙型肝炎特異性抗體庫的庫容及質量分析 134
二、定點整合抗體穩定表達細胞庫的構建及質量分析 136
三、穩定表達細胞庫的質量分析及保存 137
第四節?? 乙型肝炎表面抗原特異性抗體的篩選與鑒定 139
一、抗原的確定和處理 139
二、表達抗 HBsAg 抗體細胞的富集 143
三、表達抗 HBsAg 抗體單細胞克隆的分析鑒定 146
第七章?? 實戰技巧專題討論 153
**節?? 分子生物學研究實驗材料的特點及操作技巧 153
一、DNA 與 PCR 154
二、RNA 與基因克隆 158
三、蛋白質的穩定性及其變性 160
四、幾種特殊情況下的實用技巧 161
第二節?? 影響小提 RNA 質量和產量的因素 167
一、RNA 酶與 RNA 的質量產量 167
二、總 RNA 小提技巧 171
第三節?? 質粒 DNA 的提取與鑒定 174
一、影響小提質粒 DNA 產量質量的因素 174
二、質粒 DNA 小提技巧 179
三、陽性細菌克隆的篩選 184
四、質粒 DNA 中提實例 190
第四節?? 瓊脂糖凝膠電泳操作技巧 200
一、DNA 瓊脂糖凝膠電泳的考慮因素 201
二、DNA 瓊脂糖凝膠電泳操作技巧 205
三、實例分析：用一塊凝膠同步分析從 0.5kb 到 10kb 的 DNA 片段 216
第五節?? 抗體庫的構建與分析 218
一、構建大容量抗體基因庫需要考慮的因素 219
二、抗體庫輕重鏈的配對分析與保存 229
三、抗體穩定表達細胞庫的構建、染色、分析和分選 233
第六節?? 細胞生物學研究實驗材料的特點及操作技巧 237
一、細胞的培養與傳代 238
二、細胞的凍存與復蘇 242
參考文獻 246
引言 001
**章?? 建立哺乳動物細胞表面抗體展示技術平臺 002
**節?? 多樣化的抗體篩選技術 002
一、雜交瘤技術 004
二、B 淋巴細胞單克隆技術 005
三、細胞表面抗體展示技術 005
四、哺乳動物細胞表面全長抗體展示技術 006
第二節?? 全長抗體在哺乳動物細胞表面的展示和分析 008
一、單基因表達系統的選擇 008
二、分泌型全長抗體的表達和分析 009
三、展示型全長抗體的表達和分析 012
四、抗原與展示型抗體的結合具有劑量依賴性 026
第三節?? 同步表達展示型和分泌型抗體 028
一、FCS（Furin 切割序列） 028
二、表達載體的設計和構建 029
三、抗體表達細胞 030
四、展示型抗體的分析 032
五、分泌型抗體的分析 033
第二章?? 哺乳動物細胞表面抗體展示技術平臺的應用 038
**節?? 篩選抗原特異性抗體 038
第二節?? 分析不同抗體的表達強度 040
一、抗體的選擇 040
二、具體的實驗和分析過程 040
第三節?? 篩選高親和力抗體 045
第四節?? 分析鑒定中和抗體 054
第三章?? 應用哺乳動物細胞表面抗體展示技術優化抗體親和力 058
**節?? 隨機突變展示型抗體基因庫的構建及分析 058
一、抗體及突變位點的選擇 058
二、突變方案及引物設計 060
三、抗體基因庫的構建及分析 060
第二節?? 細胞水平抗體庫的構建及高中和活性抗體的篩選 063
一、細胞庫的構建及分析 063
二、陽性抗體克隆的分選與分析 064
三、陽性抗體突變位點氨基酸的變化與中和活性的提高 065
第四章?? 展示型全長人源一級抗體庫的構建及分析 067
**節?? 表達載體的構建 068
一、啟動子的選擇 068
二、限制性內切酶的選擇 068
第二節?? 抗體基因庫的擴增 078
一、基本思路 078
二、設計合成擴增引物 080
三、外周血淋巴細胞總 RNA 提取 084
四、基因庫 cDNA **鏈的合成 085
第三節?? 抗體庫的常規構建 091
第四節?? 抗體庫的快速構建 100
人源抗體重鏈可變區和全長輕鏈基因擴增引物的分組 100
第五章?? 定向快速高效多片段分子克隆與二級抗體庫的構建 114
**節?? 需求與可行性 114
第二節?? 雙表達載體的設計與構建 116
一、雙表達載體需要的功能組分 116
二、雙表達載體的設計 117
三、引物的設計及 DNA 片段的 PCR 合成 118
四、4 片段定向連接構建雙表達載體 119
五、分析雙表達載體的抗體表達功能 120
六、4 個片段的自我連接與定向連接分析 121
七、4 片段定向連接效率分析 123
第三節?? 用 4 片段定向連接快速高效構建二級抗體庫 124
第六章?? 乙型肝炎病毒表面抗原特異性抗體的篩選 126
**節?? 從抗體庫篩選特異性抗體的思路 126
一、一級抗體庫的特點及篩選難度 126
二、二級抗體庫與定點整合系統的局限性 127
三、從細胞展示抗體庫中篩選特異性抗體的設想 128
四、從定點整合二級免疫抗體庫開始是一個可行的方案 129
第二節?? 乙型肝炎特異性一級庫的構建及分析 129
一、為什么選擇篩選乙型肝炎病毒表面抗原特異性抗體 129
二、PBMC 的需求及總 RNA 的提取 131
三、一級抗體庫的庫容及質量分析 131
第三節?? 雙表達定點整合乙型肝炎特異性抗體庫的構建及分析 134
一、載體水平定點整合乙型肝炎特異性抗體庫的庫容及質量分析 134
二、定點整合抗體穩定表達細胞庫的構建及質量分析 136
三、穩定表達細胞庫的質量分析及保存 137
第四節?? 乙型肝炎表面抗原特異性抗體的篩選與鑒定 139
一、抗原的確定和處理 139
二、表達抗 HBsAg 抗體細胞的富集 143
三、表達抗 HBsAg 抗體單細胞克隆的分析鑒定 146
第七章?? 實戰技巧專題討論 153
**節?? 分子生物學研究實驗材料的特點及操作技巧 153
一、DNA 與 PCR 154
二、RNA 與基因克隆 158
三、蛋白質的穩定性及其變性 160
四、幾種特殊情況下的實用技巧 161
第二節?? 影響小提 RNA 質量和產量的因素 167
一、RNA 酶與 RNA 的質量產量 167
二、總 RNA 小提技巧 171
第三節?? 質粒 DNA 的提取與鑒定 174
一、影響小提質粒 DNA 產量質量的因素 174
二、質粒 DNA 小提技巧 179
三、陽性細菌克隆的篩選 184
四、質粒 DNA 中提實例 190
第四節?? 瓊脂糖凝膠電泳操作技巧 200
一、DNA 瓊脂糖凝膠電泳的考慮因素 201
二、DNA 瓊脂糖凝膠電泳操作技巧 205
三、實例分析：用一塊凝膠同步分析從 0.5kb 到 10kb 的 DNA 片段 216
第五節?? 抗體庫的構建與分析 218
一、構建大容量抗體基因庫需要考慮的因素 219
二、抗體庫輕重鏈的配對分析與保存 229
三、抗體穩定表達細胞庫的構建、染色、分析和分選 233
第六節?? 細胞生物學研究實驗材料的特點及操作技巧 237
一、細胞的培養與傳代 238
二、細胞的凍存與復蘇 242
參考文獻 246
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分子生物學細胞生物學實驗實戰技巧 作者簡介
周辰，1978年廣州第一軍醫大學軍醫系畢業。1983年西安第四軍醫大學,生物化學專業碩士。1995年西安第四軍醫大學,分子生物學專業博士。曾任美國南加州大學附屬兒童醫院免疫和骨髓移植系研究員、美國加州圣地亞哥Immusol生物公司高級研究員、南方醫科大學客座教授/特聘教授，雙展生物(賀州)科技有限公司聯合創始人、總經理。細胞周期與基因表達調控、抗艾滋病基因治療藥物的研發、抗血栓抗體新藥的研發等方面取得顯著進展，發表論文22篇、出版著作3部，獲得專利3項。 楊于軍，1974-1978：南方醫科大學（第一軍醫大學）醫學博士，1989-1992：美國南加州大學附屬兒童醫院血液-腫瘤系博士后。先后任美國南加州大學附屬兒童醫院血液-腫瘤系博士后研究員、美國南加州大學附屬兒童醫院免疫和血液腫瘤系研究專員-III、實驗室經理，美國斯坦福大學兒童醫院兒科系造血干細胞血液-骨髓移植系生命科學研究專員，瀧搌（上海）生物科技有限公司研發部高級經理。
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