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基因工程實驗教程
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基因工程實驗教程 版權信息
- ISBN：9787030373069
- 條形碼：9787030373069 ; 978-7-03-037306-9
- 裝幀：暫無
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：
基因工程實驗教程 內容簡介
全書共包括有二十一個基因工程方面的基本實驗，同時也涵蓋了與基因工程密切相關的部分細胞培養技術、生物信息學微機操作技術等內容，書后還附有基因工程常用試劑配制、實驗室常用數據和實驗室安全的一般常識。每個實驗都配有基礎知識鏈接和背景資料的介紹，對每個實驗的原理和操作步驟以及所出現問題的分析，力求解釋詳盡，以便于讀者能較快地掌握實驗原理和操作技巧。
基因工程實驗教程 目錄
目錄
**部分 基因工程實驗
**章 組織細胞遺傳物質的提取（1）
實驗一 動物胸腺或脾臟有核細胞基因組DNA提取（1）
實驗二 哺乳動物組織mRNA提取（3）
實驗三 植物組織的基因組DNA提取（6）
實驗四 植物細胞RNA提取（8）
實驗五 細菌基因組DNA的制備（10）
實驗六 大腸桿菌質粒DNA的小量提取（12）
第二章 核酸凝膠電泳分離與純化方法（15）
實驗七 核酸的瓊脂糖凝膠電泳（15）
實驗八 DNA片段的回收與純化（17）
實驗九 紫外分光光度法測定核酸含量（19）
實驗十 PCR反應及其產物檢測（21）
第三章 DNA的重組連接和克隆的篩選鑒定（27）
實驗十一 限制性內切酶切割DNA（27）
實驗十二 DNA的重組和連接（32）
實驗十三 大腸桿菌感受態細胞的制備和重組DNA分子的轉化（35）
實驗十四 重組轉化子DNA的鑒定（藍白斑篩選法）（39）
實驗十五 轉化克隆的篩選和鑒定（41）
實驗十六 工程菌的誘導和酶活性檢測（44）
實驗十七 SDS PAGE電泳（48）
第四章 綜合大實驗（54）
實驗十八 基因工程綜合大實驗（54）
實驗十九 植物基因轉化與轉基因植株鑒定（57）
第五章 基因工程相關的其他實驗方法（65）
實驗二十 限制性片段長度多態性（RFLP）分析（65）
實驗二十一 免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達（67）
第二部分 細胞培養技術
第六章 細胞培養的一般操作過程（74）
實驗二十二實驗器械、器皿的清洗、包裝和消毒（74）
實驗二十三 應用微孔濾膜過濾除菌（78）
實驗二十四 細胞培養用液的配制（80）
實驗二十五 小鼠腎臟細胞原代培養（82）
實驗二十六 動物細胞的傳代培養（85）
實驗二十七 煙草葉片愈傷組織誘導和器官發生（86）
實驗二十八 培養細胞的凍存與復蘇（89）
實驗二十九 細胞計數（91）
實驗三十 細胞活力的測定方法（93）
實驗三十一 動物細胞融合（94）
實驗三十二 MTT法檢測細胞相對數和相對活力（97）
實驗三十三 細胞的基因轉染實驗—脂質體法（99）
第三部分 生物信息學
第七章 生物信息學實驗（103）
實驗三十四 生物信息學數據庫（103）
實驗三十五 核酸序列檢索（106）
實驗三十六 原核與真核生物核酸序列分析（109）
實驗三十七 核酸序列分析和引物設計（120）
實驗三十八 蛋白質序列分析（130）
第四部分附錄
第八章 基因工程常用試劑配制及常用數據（141）
附錄一 基因工程常用試劑配制（141）
附錄二 PCR引物設計時常用Ⅱ型限制性內切酶的酶切位點保護堿基（154）
附錄三 常用的基因工程型宿主菌的相關信息（157）
附錄四 基因工程常用數據（159）
附錄五 常用化學試劑的一般常識（167）
附錄六 分子生物學綜合數據庫工具箱（176）
**部分 基因工程實驗
**章 組織細胞遺傳物質的提取（1）
實驗一 動物胸腺或脾臟有核細胞基因組DNA提取（1）
實驗二 哺乳動物組織mRNA提取（3）
實驗三 植物組織的基因組DNA提取（6）
實驗四 植物細胞RNA提取（8）
實驗五 細菌基因組DNA的制備（10）
實驗六 大腸桿菌質粒DNA的小量提取（12）
第二章 核酸凝膠電泳分離與純化方法（15）
實驗七 核酸的瓊脂糖凝膠電泳（15）
實驗八 DNA片段的回收與純化（17）
實驗九 紫外分光光度法測定核酸含量（19）
實驗十 PCR反應及其產物檢測（21）
第三章 DNA的重組連接和克隆的篩選鑒定（27）
實驗十一 限制性內切酶切割DNA（27）
實驗十二 DNA的重組和連接（32）
實驗十三 大腸桿菌感受態細胞的制備和重組DNA分子的轉化（35）
實驗十四 重組轉化子DNA的鑒定（藍白斑篩選法）（39）
實驗十五 轉化克隆的篩選和鑒定（41）
實驗十六 工程菌的誘導和酶活性檢測（44）
實驗十七 SDS PAGE電泳（48）
第四章 綜合大實驗（54）
實驗十八 基因工程綜合大實驗（54）
實驗十九 植物基因轉化與轉基因植株鑒定（57）
第五章 基因工程相關的其他實驗方法（65）
實驗二十 限制性片段長度多態性（RFLP）分析（65）
實驗二十一 免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達（67）
第二部分 細胞培養技術
第六章 細胞培養的一般操作過程（74）
實驗二十二實驗器械、器皿的清洗、包裝和消毒（74）
實驗二十三 應用微孔濾膜過濾除菌（78）
實驗二十四 細胞培養用液的配制（80）
實驗二十五 小鼠腎臟細胞原代培養（82）
實驗二十六 動物細胞的傳代培養（85）
實驗二十七 煙草葉片愈傷組織誘導和器官發生（86）
實驗二十八 培養細胞的凍存與復蘇（89）
實驗二十九 細胞計數（91）
實驗三十 細胞活力的測定方法（93）
實驗三十一 動物細胞融合（94）
實驗三十二 MTT法檢測細胞相對數和相對活力（97）
實驗三十三 細胞的基因轉染實驗—脂質體法（99）
第三部分 生物信息學
第七章 生物信息學實驗（103）
實驗三十四 生物信息學數據庫（103）
實驗三十五 核酸序列檢索（106）
實驗三十六 原核與真核生物核酸序列分析（109）
實驗三十七 核酸序列分析和引物設計（120）
實驗三十八 蛋白質序列分析（130）
第四部分附錄
第八章 基因工程常用試劑配制及常用數據（141）
附錄一 基因工程常用試劑配制（141）
附錄二 PCR引物設計時常用Ⅱ型限制性內切酶的酶切位點保護堿基（154）
附錄三 常用的基因工程型宿主菌的相關信息（157）
附錄四 基因工程常用數據（159）
附錄五 常用化學試劑的一般常識（167）
附錄六 分子生物學綜合數據庫工具箱（176）
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基因工程實驗教程 節選
**部分基因工程實驗 **章組織細胞遺傳物質的提取 實驗一動物胸腺或脾臟有核細胞基因組DNA提取 一、相關知識鏈接 生物的基因組（genome）是指一套染色體中的完整DNA序列。二倍體生物由兩套染色體組成，其中一套染色體的DNA序列就是一個基因組。基因組一詞可以特指核基因組，亦可用來表示細胞質基因組，如粒線體基因組或葉綠體基因組等。 胸腺和脾臟是哺乳動物重要的免疫器官，胸腺主要是T細胞分化和成熟的場所，具有免疫調節和自身免疫耐受的建立和維持等功能。脾臟是T和B淋巴細胞的定居場所，同時也是免疫應答的發生場所，在胚胎期還有造血功能。T和B淋巴細胞均具有全套的基因組DNA，通過胸腺或脾臟有核細胞基因組DNA的提取，可以為研究相關哺乳動物的遺傳物質提供物質基礎。 二、實驗原理 應用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）在較高溫度條件下裂解細胞，同時聯合使用蛋白酶K，使組織或細胞中蛋白質（尤其是核酸酶）充分降解，使染色體離析，蛋白變性，并釋放出核酸，然后采用鹽溶的方法，加人高濃度的飽和NaCl溶液，*后采用等體積的異丙醇沉淀DNA，以達到釋放和萃取高質量核酸的目的。 三、實驗目的 掌握從動物組織中提取DNA的操作方法，制備高質量的基因組DNA，作為PCR擴增的模板或基因組分析。 四、實驗材料和配方 （一）實驗器材與設備 恒溫水浴鍋，高速臺式離心機，漩渦振蕩器，高壓滅菌鍋，電子天平，低溫冰箱，手術剪，微量移液器（10000、1000），加樣槍頭（1000pl、100pl），1.5ml離心管。 （二）試劑與配方 1.DNA提取液10mmol/LTiis-HCl（pH8.0），2mmol/LEDTA（PH8.0），0.4mmol/LNaCl，1%SDS。 2.其他試劑蛋白酶K（20mg/ml），異丙醇，70%乙醇溶液，無水乙醇，6mol/LNaCl，溴化乙錠（EB）染色液。 五、實驗方法和步驟 1.將用于抽提DNA的動物組織（胸腺或脾臟組織）約50mg放人1.5ml離心管中，用手術剪剪碎成勻漿。 2.加人500+1的DNA提取液和200蛋白酶K，充分混勻后，55～65T水浴2～3h。 3.加人375+1的6mo1/LNaCl溶液，在漩渦振蕩器上振蕩30see。 4.12000g條件下離心30min后，量取上清液，加人等體積異丙醇，-20℃靜置40min。 5.12000g離心15min后，棄去上清液，70%乙醇洗滌沉淀1次，無水乙醇洗滌沉淀1次。 6.空氣中自然干燥沉淀后，加20+1無菌水溶解DNA。 7.取5μ1進行電泳鑒定。 電泳操作步驟如下。 （1）倒膠：取出有機玻璃內槽及隔板，洗凈、晾干。將有機玻璃內槽置于水平位置且在其一端和中間插人隔板（即只制半塊膠），為防止漏膠，可用滴管吸取少量的凝膠封好隔板邊沿，然后放好樣品梳子，并使梳齒高于底板約1.0mm。 將已配制好的0.8%瓊脂糖凝膠溶液，連同錐形瓶放進微波爐加熱，直至瓊脂糖完全熔化’待瓊脂糖凝膠液冷卻至60～70T，小心地倒在有機玻璃板內槽’控制好倒膠速度’使膠液緩慢地展開，直至在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層（膠厚約4mm），室溫下靜置30min左右，待凝膠完全凝固后（白色透明），取下有機玻璃板內槽兩端的隔板，再將內槽放人電泳槽中，加人電極緩沖液，使液面高出膠面1～2mm。輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的樣品孔。 （2）上樣：取長約10cm的透明膠（或封口膜）貼在實驗桌上，間隔2cm，用微量移液器依次點上1+1DNA上樣緩沖液，然后量取3～5+1樣品與其在透明膠上混勻，再小心吸取樣品并將其加人到樣品孔內。加樣時應避免槍頭戳破樣品孔，同時也要避免碰壞樣品槽周圍的凝膠面。操作時可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撐桌面，防止點樣時右手晃動。同時，在樣品孔的一端點上DNA分子量標準物（DNAMarker）以便于比較待測樣品分子量大小。 （3）電泳：加樣完畢，蓋上電泳槽蓋，將靠近樣品一端連接負極，另一端連接正極（注意電極方向，勿接反了），接通電源，調節電壓100V開始電泳。當溴酚藍指示劑移動到凝膠長度的4/5距離左右，可停止電泳。 （4）染色：將電泳后的凝膠板小心推至EB染色液中，室溫下浸泡15min。 （5）觀察：戴三層一次性手套，用專用鏟子從凝膠染液中小心取出凝膠置于托盤上，在凝膠成像儀上將凝膠板推至成像儀內部的黑色玻璃板上，在波長大于254nm的紫外透射光下進行觀察。DNA存在位置呈現亮帶，電腦拍照，保存圖譜。 六、結果分析與討論 圖1-1顯示所提動物總DNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，所提取得到的DNA大片段大于20kl）（DNAMarker為λDNA/EcoRI￣HindⅢ酶切片段，即*大片段為21．2kb）。 **章組織細胞遺傳物質的提取 七、注意事項 1.在基因組DNA提取之前，需將動物組織處理成勻漿。 2.在DNA提取過程中，染色體DNA會由于機械剪切力發生斷裂，產生大小不同的片段，因此在細胞破裂后，應盡量在溫和條件下操作。 3.提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，混勻試劑、吸取上清等操作時均應避免動作劇烈，以保證DNA的完整性，為后續的實驗打下基礎。 （李惠敏 劉紅美 譚濤 張潔 馮樂平） 實驗二哺乳動物組織mRNA提取 一、相關知識鏈接 1961年Jacob和Jacques Monod提出了信使RNA假說，認為細胞內肯定存在一種特殊的RNA是直接從DNA上合成的，它們的序列與DNA上的基因序列互補，然后被運輸到細胞質中為蛋白質合成提供模板。mRNA的假說很快得到了Brenner、Jacob和Meselson等科學家的同位素實驗確認，從而解決了遺傳信息傳遞的問題。 生物細胞中的RNA主要包括信使RNA（mRNA），轉運RNA（tRNA）和核糖體RNA（rRNA）以及各種特殊功能的小分子RNA等。mRNA是合成蛋白質的模板，tRNA是轉運氨基酸的運載工具，rRNA則是蛋白質翻譯場所核糖體的重要構成部件，mRNA的堿基序列，決定著蛋白質裝配時氨基酸的序列，因此，研究RNA具有重要的生物學意義。 二、實驗原理 絕大多數哺乳動物細胞的mRNA在其端均有一個poly（A）尾端，因此可以應用oligo（dT）纖維素親和層析法從細胞總RNA中分離出mRNA。當總RNA流經oligo（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo（dT）纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗脫下來。經過兩次oligo（dT）纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃；可保存一年以上。 三、實驗目的 掌握從哺乳動物組織提取mRNA的原理和方法，提取的mRNA可以用于RT-PCR以及Northern雜父分析。 四、實驗材料和配方 （一）實驗器材與設備 冷凍臺式高速離心機，渦旋振蕩機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外分光光度計，層析柱，研缽，微量移液器，離心管。 （二）試劑與配方 1.無RNA酶滅菌水用將高溫烘烤的玻璃瓶（180T，2h）裝蒸餾水，然后加人0.01%（體積比）的DEPC（ml/ml），處理過夜后高壓滅菌。 2.75%乙醇用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝人高溫烘烤過的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。 3.1X層析柱加樣緩沖液20mmol/LTris-HCl（pH7.6），0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA（pH8.0），0.1%SDS。 4.洗脫緩沖液10mmol/LTris-HCl（pH7.6），1mmol/LEDTA（pH8.0），0.05%SDS。 5.其他試劑液氮，Trizol試劑盒，氯仿，異丙醇、3mol/LNaAc溶液（pH5.2）。 五、實驗方法和步驟 （一）總RNA的提取（Trizol法） 1.將組織在液氮中磨成粉末后，將50～100mg組織加人1mlTrizol液研磨。 （注意：樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%）。 2.研磨液室溫放置5min，然后以每1mlTrizol液加人0.2ml氯仿的比例加人氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15sec。 3.取上層水相于另一離心管中，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加人異丙醇，室溫放置10min，12000g離心10min。 4.棄去上清液，按每mlTrizol液加人至少1ml75%乙醇溶液的比例加人75%乙醇溶液，渦旋混勻，4℃7500g離心5min。 5.小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5～10min，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55～60T水溶10min。RNA可進行mRNA分離，或儲存于70%乙醇溶液并保存于-70℃。 （二）mRNA提取 1.用0.1mol/LNaOH懸浮0.5～1.0goligo（dT）纖維素。 2.將懸浮液裝人滅菌的一次性層析柱中或裝人填有經DEPC處理，并經高壓滅菌的玻璃棉巴斯德吸管中，柱床體積為0.5～1.0m1，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。 3.用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的PH<8.0。 4.將提取的總RNA液于65T溫育5min后，迅速冷卻至室溫，加人等體積2x柱層析緩沖液后上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進人柱床后，加人1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。 5.測定每一管的OD2W值，當洗脫液中OD為0時，加人2～3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。 6.于260nm測定OD值，合并含有RNA的洗脫組分。 7.加人1/10體積的3mo1/LNaAc溶液（PH5.2），應用2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻于-20℃放置30min。 8.4℃下12000g離心15min，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5min。 9.小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10min，或真空干燥10min。 10.用少量DEPC水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇溶液中并貯存于-70℃）。 mRNA在70%乙醇中-70T；可保存一年以上。纖維素柱用后可用0.3m1/LNaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加人0.02%疊氮鈉（Na%）冰箱保存，可重復使用。每次用前用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。 六、結果分析與討論 （略） 七、注意事項 1.模板mRNA的質量直接影響到cDNA合成的效率，在構建cDNA文庫時，必須經純化步驟制備mRNA模板。由于mRNA分子的結構特點，容易受RNA酶的降解，加之RNA酶極為穩定且廣泛存在，因此在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染，并設法抑制其活性，這是實驗成敗的關鍵。 2.所有組織中均存在RNA酶，試劑和容器等也均可能被污染，因此實驗過程中均需戴手套操作并經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200T烘烤2h以上。 3.凡不能用高溫烘烤的材料，如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DE
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