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生物化學與分子生物學實驗指導 版權信息
- ISBN：9787030609946
- 條形碼：9787030609946 ; 978-7-03-060994-6
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
生物化學與分子生物學實驗指導 內容簡介
本教材由常用實驗儀器的基本原理與操作、生物化學與分子生物學的基本實驗方法組成。在實驗的的編寫的選擇中，力求配合生物化學與分子生物學的理論學習，注重對學生的基本實驗操作和技能的培養，適當引進新技術和新方法寬展學生眼界。爭取做到實驗的科學性、實用性和適用性，以供全國廣大讀者使用。本書適合作為高等醫學院校的本科及研究生適用，也可供醫學生物化學及分子生物學教學和科研工作者參考。
生物化學與分子生物學實驗指導 目錄
目錄
前言
實驗須知 1
實驗基本操作 4
一、玻璃儀器的洗滌 4
二、吸量管的使用 5
三、定量吸（移）液器 5
四、容量瓶及量筒 6
五、離心機及其使用方法 6
六、溶液的混勻 6
七、保溫 7
八、過濾 7
九、加熱 7
實驗一 血清蛋白質醋酸纖維素薄膜電泳 8
實驗二 蛋白質的兩性性質及等電點測定 12
實驗三 血清蛋白質的鹽析及白球比的測定 15
實驗四 雙縮脲法測定血清蛋白質的含量 20
實驗五 凱氏定氮法測定蛋白質含量 23
實驗六 RIPA法提取肝總蛋白質 27
實驗七 血清蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳 29
實驗八 影響酶活性的因素 33
一、溫度對酶活性的影響 33
二、pH對酶活性的影響 34
三、激動劑和抑制劑對酶活性的影響 35
實驗九 酶的競爭性抑制作用 37
實驗十 維生素C的定量測定 39
實驗十一 胰島素、腎上腺素對家兔血糖濃度的影響 43
實驗十二 飽食和饑餓小白鼠肝糖原含量的比較 46
實驗十三 葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度 48
實驗十四 血清中甘油三酯的測定 51
一、方法一 52
二、方法二 53
實驗十五 血清中總膽固醇的測定 55
實驗十六 酮體的生成和利用 57
實驗十七 過氧化脂質的測定 61
實驗十八 血清中肌酐濃度的測定（除蛋白堿性苦味酸法） 63
實驗十九 核酸的定量測定（紫外吸收法） 65
實驗二十 組織DNA的提取與鑒定 68
實驗二十一 DNA和RNA濃度的檢測 71
實驗二十二 大腸桿菌質粒DNA的提取與純化 73
實驗二十三 肝總RNA的提取與瓊脂糖凝膠電泳鑒定 78
實驗二十四 反轉錄聚合酶鏈反應檢測肝甘油醛-3-磷酸脫氫酶mRNA 81
實驗二十五 大腸桿菌的轉化及重組子的篩選 87
實驗二十六 外源基因在大腸桿菌中的誘導表達 91
實驗二十七 質粒DNA的限制性內切酶消化及鑒定 94
實驗二十八 質粒DNA與外源DNA的連接 97
實驗二十九 人血管生長因子基因（hVEGF）的PCR定點突變 99
實驗三十 熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒核酸 103
生物化學與分子生物學常用儀器設備介紹 107
一、通風櫥 107
二、恒溫搖床 108
三、細菌培養箱 109
四、PCR儀 112
五、臺式高速離心機 113
六、比色分析法及721-B型分光光度計 115
七、微量移液器 117
八、數顯恒溫水浴鍋 119
九、超凈工作臺 120
十、高壓蒸汽滅菌鍋 121
十一、pH計 123
十二、渦旋儀 124
分子生物學實驗技術無菌操作原則 125
分子生物學實驗無菌操作技術及注意事項 126
一、玻璃器皿的消毒和清潔 126
二、無菌器材和液體的準備 127
三、無菌操作過程 127
四、常用清潔液的配制方法 127
實驗報告格式與內容 128
前言
實驗須知 1
實驗基本操作 4
一、玻璃儀器的洗滌 4
二、吸量管的使用 5
三、定量吸（移）液器 5
四、容量瓶及量筒 6
五、離心機及其使用方法 6
六、溶液的混勻 6
七、保溫 7
八、過濾 7
九、加熱 7
實驗一 血清蛋白質醋酸纖維素薄膜電泳 8
實驗二 蛋白質的兩性性質及等電點測定 12
實驗三 血清蛋白質的鹽析及白球比的測定 15
實驗四 雙縮脲法測定血清蛋白質的含量 20
實驗五 凱氏定氮法測定蛋白質含量 23
實驗六 RIPA法提取肝總蛋白質 27
實驗七 血清蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳 29
實驗八 影響酶活性的因素 33
一、溫度對酶活性的影響 33
二、pH對酶活性的影響 34
三、激動劑和抑制劑對酶活性的影響 35
實驗九 酶的競爭性抑制作用 37
實驗十 維生素C的定量測定 39
實驗十一 胰島素、腎上腺素對家兔血糖濃度的影響 43
實驗十二 飽食和饑餓小白鼠肝糖原含量的比較 46
實驗十三 葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度 48
實驗十四 血清中甘油三酯的測定 51
一、方法一 52
二、方法二 53
實驗十五 血清中總膽固醇的測定 55
實驗十六 酮體的生成和利用 57
實驗十七 過氧化脂質的測定 61
實驗十八 血清中肌酐濃度的測定（除蛋白堿性苦味酸法） 63
實驗十九 核酸的定量測定（紫外吸收法） 65
實驗二十 組織DNA的提取與鑒定 68
實驗二十一 DNA和RNA濃度的檢測 71
實驗二十二 大腸桿菌質粒DNA的提取與純化 73
實驗二十三 肝總RNA的提取與瓊脂糖凝膠電泳鑒定 78
實驗二十四 反轉錄聚合酶鏈反應檢測肝甘油醛-3-磷酸脫氫酶mRNA 81
實驗二十五 大腸桿菌的轉化及重組子的篩選 87
實驗二十六 外源基因在大腸桿菌中的誘導表達 91
實驗二十七 質粒DNA的限制性內切酶消化及鑒定 94
實驗二十八 質粒DNA與外源DNA的連接 97
實驗二十九 人血管生長因子基因（hVEGF）的PCR定點突變 99
實驗三十 熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒核酸 103
生物化學與分子生物學常用儀器設備介紹 107
一、通風櫥 107
二、恒溫搖床 108
三、細菌培養箱 109
四、PCR儀 112
五、臺式高速離心機 113
六、比色分析法及721-B型分光光度計 115
七、微量移液器 117
八、數顯恒溫水浴鍋 119
九、超凈工作臺 120
十、高壓蒸汽滅菌鍋 121
十一、pH計 123
十二、渦旋儀 124
分子生物學實驗技術無菌操作原則 125
分子生物學實驗無菌操作技術及注意事項 126
一、玻璃器皿的消毒和清潔 126
二、無菌器材和液體的準備 127
三、無菌操作過程 127
四、常用清潔液的配制方法 127
實驗報告格式與內容 128
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生物化學與分子生物學實驗指導 節選
實驗須知 【實驗目的】 1. 通過實驗，加深對生物化學與分子生物學理論知識的理解。 2. 較熟練地掌握生物化學與分子生物學實驗基本操作技術。 3. 培養學生具備嚴謹的科學態度和工作作風，使其分析問題和解決問題的能力逐步提高，為學習醫藥學專業課程打下基礎。 【實驗要求】 實驗前必須預習本實驗指導，復習理論知識，明確當次實驗的實驗目的、原理、操作關鍵步驟及注意事項、計劃安排、實驗時間等。實驗時嚴肅認真，一絲不茍地進行操作，仔細觀察和綜合分析實驗所出現的現象與結果，及時將現象與結果記錄下來。實驗完畢，將所在實驗組的實驗臺整理干凈，清點儀器、試劑，然后請實驗指導教師審核簽字。 【儀器保管及清潔】 1. 常用儀器在**次實驗時按儀器清單清點，簽名后自己負責保管，如有缺損應向教師報告并填寫破損單，經教師同意并簽名后到實驗準備室換領。 2. 貴重儀器如比色計、離心機等必須盡力愛護，使用前熟悉它們的使用方法，嚴格遵守操作規程，非本次實驗貴重儀器，未經教師許可不得亂動。 3. 實驗后必須把儀器洗凈，按次序放入柜內，以提高工作效率并防止破損。 【實驗時注意事項】 1. 遵守實驗課紀律，不遲到、不早退，進實驗室要穿好實驗服，避免給實驗帶來不可預知的結果，或造成衣服被酸堿腐蝕。 2. 進實驗室前準備好實驗指導、實驗記錄本、文具等，其他非實驗所需物品嚴禁帶入實驗室。 3. 實驗室是培養學生獨立思考、獨立工作的能力及良好科學作風的重要場所，操作務必認真，不得喧嘩，嚴禁用器械及動物開玩笑。實驗后要清掃臺面、地面，試劑瓶要碼放整齊。 4. 愛護公物，節約水、電、試劑，遵守損壞儀器報告、登記、賠償制度。 5. 保持實驗臺整潔，試劑、儀器應擺放整齊，按次序放置。實驗完畢按各類儀器清洗方法和要求將儀器妥善歸置。 6. 應當愛護貴重儀器，如分光光度計、離心機等，使用前熟悉其使用方法，嚴格遵守操作規程，嚴禁隨意開動。 【試劑使用規則】 1. 使用試劑前，應先仔細辨認試劑瓶標簽，看清試劑種類、濃度是否對應本次實驗。 2. 取完試劑后，立即將瓶塞蓋好，切勿蓋錯，應放回原處。未用完的試劑不得倒回瓶內。試劑瓶塞、專用吸量管、滴管應與試劑瓶對應，以免錯用而污染試劑，造成自己或他人實驗失敗。 3. 取標準溶液時，應先將其倒入干凈的試管中，再用內外潔凈吸管從試管中吸取，以免污染標準溶液。 4. 使用滴管時，須滴管尖端朝下，切勿倒置使試劑流入橡皮內，以免污染溶液。 5. 使用有毒試劑及強酸堿時，盡可能用量筒量取，若用吸管時只能用橡皮球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 【安全注意事項】 1. 低沸點有機溶劑，如乙醚、乙醇、丙酮等均為易燃物品，不得直接在火上加熱，要用水浴加熱，這些物品應遠離火源。 2. 凡屬發煙或產生有毒氣體的實驗均應在通風柜內進行，以免產生毒害。 3. 萬一發生酸堿灼傷事故，應先用大量的自來水沖洗，然后用飽和NaHCO3溶液中和酸，用飽和H3BO3溶液中和堿，用Na2SO4處理氧化劑。 4. 萬一發生起火事件，應根據起火性質分別用沙或水等滅火。 5. 離開實驗室時，必須關好門窗，切斷電源、水源。 【實驗室清潔】 1. 實驗室、實驗臺面須經常保持潔凈，實驗后應擦拭干凈，不得隨地吐痰、丟紙屑。 2. 實驗用過的固體物（如棉花、濾紙、火柴梗等）不要丟在桌上或水池中，應放入廢物缸內。 3. 下課時輪流由值日生打掃衛生，經教師檢查后，方能離開實驗室。 【值日生任務】 1. 搞好實驗室衛生，做到儀器、桌面、地面、水池等干凈、整潔。 2. 確保安全，關好儀器、門窗、水電。 3. 請指導教師及準備室教師檢查后方能離開實驗室。 【實驗報告】 每次做完實驗，須及時整理實驗記錄，依照規定格式和內容寫出實驗報告，根據實驗結果進行科學分析并交指導教師評閱。報告內容包括實驗時間、實驗地點、實驗名稱、實驗目的、實驗原理、實驗試劑與儀器、指導教師、實驗操作、實驗結果、實驗分析、實驗結論、思考題等項目。 實驗目的、實驗原理、實驗試劑與儀器及實驗操作等只作簡明扼要的敘述，不必將本實驗指導的內容原版抄錄。但對實驗條件、操作要點等實驗成敗的關鍵環節應作清楚的描述。使用精密儀器進行實驗時，還應記錄儀器的型號、名稱、廠家。 實驗結果首先是如實記錄實驗中觀察到的現象及各種原始數據，還包括根據實驗要求進行整理、歸納數據后進行計算的過程及計算結果，根據實驗數據計算作出的圖表（采用三線表）等。 實驗分析不是對結果的重述，而是對實驗結果、實驗方法和異常現象進行解析和評論，以及對實驗設計的認識、體會及建議。 一般要有實驗結論。結論簡單扼要，從而說明本次實驗所獲得的結果。 實驗報告根據以往開設實驗的情況，具備封面及報告正文。格式見附錄“實驗報告格式與內容”。 實驗基本操作 生物化學與分子生物學實驗中需要多種基本技術操作，如各種玻璃儀器和測量儀器的正確使用、樣品混勻、保溫、加熱、沉淀、過濾和離心等。如果這些操作不規范，將影響實驗結果的準確性。因此，要求學生對生物化學與分子生物學實驗基本操作加以了解和掌握，是非常重要的。 生物化學與分子生物學實驗多用定性及定量分析方法觀察物質代謝的規律，必須做到潔凈及定量的準確，為做好這一點，我們先介紹一些基本操作，并要求學生反復練習，以達到熟練的程度。 一、玻璃儀器的洗滌 在生物化學與分子生物學實驗中，玻璃儀器清潔是獲得準確結果重要的一環。潔凈玻璃儀器的內壁應十分明亮光潔，無水珠附著在管壁上，下面介紹一些常用的洗滌方法。 1. 一般儀器如燒杯、試管等，可用合成洗滌劑、去污粉等和毛刷仔細刷洗后，再用自來水沖干凈。*后用少量的蒸餾水沖洗2～3次，倒置晾干或置烘箱烘干后備用。 2. 容量分析儀器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗，可在用畢后即用自來水沖洗，直至不掛水珠，再用少量的蒸餾水沖洗2～3次即可晾干備用。若沖洗后的儀器仍掛水珠，則應將其瀝干后，再用重鉻酸鉀洗液浸泡4～6h，然后用自來水沖洗干凈，再用少量蒸餾水沖洗2～3次。 3. 比色杯用畢立即用自來水反復沖洗，如有污染物黏附于杯壁，宜用鹽酸或適當的溶劑清洗。然后用自來水、蒸餾水沖洗干凈。勿用刷子、粗糙布等擦拭。洗凈后倒置晾干備用。 4. 新購量器表面常附有游離的堿性物質及泥污，可先用去污粉刷洗再用自來水洗凈，然后浸泡在1%～2%鹽酸溶液中過夜（不少于4h），再進一步洗滌，然后用蒸餾水蕩洗2～3次，倒置于儀器架上晾干備用。 二、吸量管的使用 吸量管是用來轉移一定體積溶液的量器，生物化學與分子生物學實驗中常用的吸量管有以下三種。 1. 刻度吸量管：刻度吸量管有0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL等規格。刻度吸量管又分刻度到尖端和刻度不到尖端兩種，使用前需仔細辨認，如使用前者，將液體放出后，應用洗耳球吹出*后留在管內的液體。 2. 移液吸量管：也稱容量吸管或胖肚吸管，是一種單一刻度吸管，中間呈圓柱狀膨大，為定量移出整量液體之用。有5mL、10mL、20mL、25mL、50mL及100mL等規格。將所量取液體放出后，只需將移液吸量管尖端觸及受器壁約半分鐘即可，不得吹出尖端液體。如管壁刻有吹字，則應吹出。 3. 奧氏吸量管：又稱歐氏吸管，也是一種單一刻度的吸管，中下部呈球形膨大，故液體與吸量管表面接觸面積較小，用于吸取血液及較黏的液體。流放液體時，應讓其自然緩慢地流出，減少內壁黏附。若為吹出式，管尖*后一小滴應吹出。有1.0mL、2.0mL、5.0mL等規格。 正確使用方法：使用吸量管時，先要看清刻度情況，選擇適當容量的吸量管（等于或稍大于所需毫升數）。拿吸量管時，標有刻度的一面正對己側，以便讀取刻度。用右手中指和拇指拿住吸量管上部，把管尖端插入要取液體大約0.1cm深處。左手持洗耳球把容器內的液體吸至刻度上方時，立即用右手食指按住吸量管管口，以穩住吸量管內的液體，將吸量管下端提出液面，慢慢松開食指使液面的月彎面*低點下降至所需刻度處（眼睛與刻度線處于同一水平面上），立即用食指堵緊，然后將吸量管插到需加液體容器中，讓其尖端與容器內壁靠緊，松開食指讓液體流出。液體流完后再等15s，捻動一下吸量管后移去。 三、定量吸（移）液器 定量吸（移）液器是吸量管的革新產品，使用方便，取、加樣迅速，計量準確，不易破損，能吸取多種樣品（只換吸嘴即可）。定量吸（移）液器有以下兩種類型。 1. 固定式：只能取、加一定容量，不能調節。 2. 可調式：在一定容量范圍內可根據需要調節取、加量，如0～200μL。 四、容量瓶及量筒 容量瓶是一種細長頸梨形平底瓶，具有磨口塞，頸上有標線，表示所示溫度（一般為 20℃）條件下，當液體充滿到標線時，液體體積恰好與瓶上所注明的體積相等。容量瓶有10mL、25mL、50mL、100mL、200mL、250mL、500mL、1000mL、2000mL等規格。使用容量瓶裝配制的溶液時，一般是先將固體物質在燒杯中用少量溶劑溶解，然后將溶液沿玻璃棒定量地轉移到容量瓶中，燒杯用少量的蒸餾水沖洗2～3次，并注入容量瓶中，再加入溶劑混勻稀釋。當稀釋至液面接近標線時，應等待1～2min，使附在瓶頸內壁的液體流下，并待液面的小氣泡消失后，再用滴管逐滴加入溶劑，使之恰至刻度處，即溶液彎月面下緣*低點和標線相切。然后將其瓶塞塞好，反復倒置搖動數次使其充分混勻。容量瓶不能直接用火加熱，水浴加熱時不宜驟熱和驟冷，也不能置于烘箱烘烤，以免變形而引起容量發生誤差。 量筒：所量取液體不用十分精確時可使用量筒，比使用吸管或容量瓶更簡便，量筒底座及筒身是一體的，故不能量取過熱液體，更不能直接加熱，以防炸裂。 五、離心機及其使用方法 離心法是分離沉淀物的一種方法。它是利用離心機轉動的離心力，使相對密度較大的沉淀物沉積在管底部，以達到分離的目的。離心機使用方法如下。 1. 檢查離心機套管底部墊子，若有玻璃碎片等，必須除去，以免發生破管。 2. 將待離心液體置于離心管或小試管中，并檢查離心管（或小試管）的大小與離心機套管是否匹配。 3. 將盛有離心液的離心管分別放入套管中，然后連套管一起分置于托盤天平兩側，通過往離心管與套管間滴加水來調節兩邊質量使之達到平衡。 4. 將已平衡的兩支裝有離心管的套管分別放入離心機相互對應的兩插孔內，蓋上離心機蓋。打開電源開關，逐步扭動轉速旋鈕，緩慢增加離心機轉速至所需轉速。達到離心所需時間后將轉速旋鈕逐步回零，待離心機自然停止轉動后，取出離心管，關閉電源。 六、溶液的混勻 欲使化學反應充分進行，必須使反應體系內的各種物質迅速地相互接觸。溶液混勻可隨使用器皿、液體容量而選用下列不同的方法。
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