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動物病毒樣顆粒技術(shù) 版權(quán)信息
- ISBN：9787030733856
- 條形碼：9787030733856 ; 978-7-03-073385-6
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數(shù)：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
動物病毒樣顆粒技術(shù) 內(nèi)容簡介
該書共包括15章，詳細介紹了病毒樣顆粒的基本特征及在基礎(chǔ)研究、藥物呈遞、疫苗工程等方面的應(yīng)用價值。系統(tǒng)描述了應(yīng)用大腸桿菌表達系統(tǒng)、動物細胞表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)、植物表達系統(tǒng)、痘病毒表達系統(tǒng)、無細胞培養(yǎng)系統(tǒng)等制備病毒樣顆粒的策略、步驟或程序。同時介紹了目的蛋白的純化鑒定的基本方法。介紹了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)病毒樣顆粒應(yīng)注意的問題和解決困難的思路。本專著將納米技術(shù)概念引入動物疫苗研究領(lǐng)域在國內(nèi)尚屬首次。
動物病毒樣顆粒技術(shù) 目錄
目錄
**章緒論1
**節(jié)病毒樣顆粒的概念及特點1
一、病毒樣顆粒的概念1
二、病毒樣顆粒的特點及優(yōu)勢1
三、病毒樣顆粒的不足2
第二節(jié)病毒樣顆粒的分類3
第三節(jié)病毒樣顆粒的發(fā)展歷程3
一、病毒樣顆粒技術(shù)的進展3
二、病毒樣顆粒相關(guān)表達系統(tǒng)的發(fā)展4
三、病毒樣顆粒組裝技術(shù)的發(fā)展5
參考文獻6
第二章桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)9
**節(jié)概述9
一、桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)點9
二、桿狀病毒載體9
三、宿主11
四、外源基因的表達13
第二節(jié)桿狀病毒-昆蟲細胞表達技術(shù)13
一、桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)的發(fā)展13
二、高效表達策略15
第三節(jié)Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的VLP制備17
一、載體的選擇17
二、目的基因的克隆21
三、培養(yǎng)昆蟲細胞21
四、重組bacmid的構(gòu)建21
五、使用PCR分析重組質(zhì)粒22
六、VLP的制備23
第四節(jié)桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)在VLP研究中的進展24
一、無囊膜病毒26
二、囊膜病毒28
三、瓶頸和問題30
四、展望34
五、附錄34
參考文獻41
第三章酵母表達系統(tǒng)44
**節(jié)概述44
一、酵母表達系統(tǒng)簡介44
二、常用酵母表達系統(tǒng)分類47
第二節(jié)酵母表達技術(shù)55
一、酵母表達技術(shù)概述55
二、酵母表達技術(shù)的高效表達策略56
第三節(jié)酵母表達系統(tǒng)在VLP研究中的進展61
一、概述61
二、酵母表達系統(tǒng)在人源病毒VLP中的研究62
三、酵母表達系統(tǒng)在動物病毒VLP中的研究65
第四節(jié)展望68
參考文獻69
第四章活病毒載體表達系統(tǒng)74
**節(jié)痘病毒表達系統(tǒng)74
一、痘病毒的分類74
二、痘病毒基因組特點74
三、痘病毒表達載體及其應(yīng)用75
第二節(jié)腺病毒表達系統(tǒng)80
一、腺病毒生物學(xué)特點80
二、腺病毒的分類81
三、腺病毒感染及免疫應(yīng)答機制83
四、重組腺病毒的構(gòu)建85
五、腺病毒表達系統(tǒng)在VLP研究中的進展85
第三節(jié)腺相關(guān)病毒表達系統(tǒng)86
一、腺相關(guān)病毒病原學(xué)特點87
二、腺相關(guān)病毒衣殼組裝87
三、腺相關(guān)病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答88
四、重組腺相關(guān)病毒制備89
五、腺相關(guān)病毒遞送系統(tǒng)的應(yīng)用92
六、腺相關(guān)病毒遞送系統(tǒng)發(fā)展展望94
第四節(jié)慢病毒表達系統(tǒng)94
一、慢病毒表達系統(tǒng)概述95
二、重組慢病毒制備與生產(chǎn)97
三、慢病毒表達系統(tǒng)的應(yīng)用101
四、慢病毒載體系統(tǒng)發(fā)展展望103
五、附錄103
參考文獻105
第五章哺乳動物細胞表達系統(tǒng)108
**節(jié)CHO細胞表達系統(tǒng)108
一、CHO細胞表達載體特征111
二、宿主細胞的優(yōu)化113
三、真核表達載體轉(zhuǎn)染技術(shù)113
四、哺乳動物細胞培養(yǎng)條件115
五、CHO制備VLP研究的進展116
第二節(jié)HEK293細胞表達系統(tǒng)119
一、HEK293細胞系發(fā)展歷史119
二、HEK293細胞表達載體特征121
三、HEK293生產(chǎn)蛋白質(zhì)制劑的優(yōu)點122
四、HEK293真核表達載體的轉(zhuǎn)染123
五、HEK293細胞制備VLP的研究進展123
第三節(jié)細胞培養(yǎng)工藝研究129
一、細胞培養(yǎng)環(huán)境的控制129
二、生物反應(yīng)器130
三、動物細胞流加培養(yǎng)工藝131
四、流加培養(yǎng)的細胞代謝及其基因調(diào)控132
第四節(jié)穩(wěn)定表達重組蛋白的哺乳動物細胞系133
一、利用綠色熒光蛋白（GFP）構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系134
二、利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系135
三、利用噬菌體φC31整合酶構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系135
四、利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系136
五、問題136
第五節(jié)展望136
參考文獻137
第六章植物表達系統(tǒng)140
**節(jié)植物表達系統(tǒng)概述140
一、植物表達系統(tǒng)的組成140
二、植物表達系統(tǒng)種類142
第二節(jié)植物表達系統(tǒng)表達技術(shù)143
一、植物表達系統(tǒng)常用載體及工程菌株143
二、提高目的蛋白表達水平的手段146
三、植物表達系統(tǒng)表達重組蛋白純化工藝149
第三節(jié)植物表達系統(tǒng)在VLP中的研究進展151
一、囊膜病毒153
二、無囊膜病毒159
第四節(jié)展望162
參考文獻163
第七章原核表達系統(tǒng)166
**節(jié)大腸桿菌表達系統(tǒng)概述及技術(shù)166
一、大腸桿菌表達系統(tǒng)的組成166
二、大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達的策略169
三、VLP在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達與組裝173
第二節(jié)其他原核表達系統(tǒng)（乳酸菌、鏈霉菌）概述及技術(shù)174
一、乳酸菌175
二、鏈霉菌179
第三節(jié)原核表達系統(tǒng)在VLP中的研究進展181
一、囊膜病毒181
二、無囊膜病毒184
第四節(jié)展望189
參考文獻190
第八章無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)195
**節(jié)無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)發(fā)展史195
第二節(jié)無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的優(yōu)點和不足197
一、CFPS的優(yōu)點197
二、CFPS存在的問題197
第三節(jié)無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)分類及研究進展198
一、細胞提取物來源CFPS199
二、“PURE”系統(tǒng)CFPS203
三、CFPS的生產(chǎn)方式204
第四節(jié)CFPS的主要應(yīng)用領(lǐng)域205
一、特殊蛋白質(zhì)的合成205
二、蛋白質(zhì)高通量表達和篩選206
三、合成藥物207
第五節(jié)CFPS在VLP制備中的研究進展207
一、無囊膜病毒207
二、囊膜病毒209
第六節(jié)展望212
參考文獻212
第九章病毒樣顆粒的表征技術(shù)215
**節(jié)概述215
第二節(jié)生物化學(xué)分析技術(shù)216
一、MS技術(shù)216
二、SDS-PAGE技術(shù)218
三、RP-HPLC技術(shù)219
第三節(jié)生物物理學(xué)分析技術(shù)220
一、TEM220
二、Cryo-EM221
三、AFM222
四、DLS技術(shù)224
五、圓盤離心技術(shù)225
六、ES-DMA技術(shù)226
七、AF4技術(shù)227
八、Native-PAGE技術(shù)229
九、密度梯度離心技術(shù)229
十、AUC技術(shù)232
第四節(jié)免疫生物學(xué)分析技術(shù)234
一、ELISA技術(shù)234
二、SPR技術(shù)235
參考文獻237
第十章動物病毒樣顆粒疫苗241
**節(jié)VLP疫苗概述241
一、VLP疫苗的優(yōu)勢241
二、VLP疫苗的多樣性242
三、VLP疫苗的應(yīng)用246
四、VLP疫苗的分類249
五、展望251
第二節(jié)VLP的免疫機制251
一、抗原呈遞細胞的種類、功能251
二、抗原呈遞細胞在VLP疫苗免疫中的作用254
三、B細胞及VLP誘導(dǎo)的B細胞免疫應(yīng)答255
四、主要組織相容性復(fù)合體257
五、抗原呈遞途徑258
六、T細胞及VLP誘導(dǎo)的T細胞免疫應(yīng)答259
第三節(jié)VLP疫苗的研究261
一、人類與人畜共患病VLP疫苗262
二、豬的VLP疫苗274
三、反芻動物的VLP疫苗279
四、禽類的VLP疫苗282
五、兔、魚、犬、貂和貓的VLP疫苗287
參考文獻292
第十一章病毒及病毒樣顆粒作為納米藥物遞送載體305
**節(jié)納米藥物遞送系統(tǒng)概述305
一、納米藥物遞送系統(tǒng)305
二、常見納米藥物遞送載體的分類及特性311
三、病毒及病毒樣顆粒類納米藥物遞送載體314
第二節(jié)病毒及病毒樣顆粒承載藥物的機制和原理316
一、從材料學(xué)與化學(xué)的角度看VNP/VLP316
二、VNP/VLP的解離-自組裝特性317
三、物理吸附法317
四、化學(xué)修飾法318
第三節(jié)病毒及病毒樣顆粒作為納米藥物遞送載體的研究進展322
一、植物VNP/VLP作為納米藥物遞送載體322
二、人/動物VNP/VLP作為納米藥物遞送載體334
三、噬菌體VNP/VLP作為納米藥物遞送載體340
四、展望345
參考文獻345
第十二章病毒樣顆粒作為核酸的遞送載體348
**節(jié)核酸類藥物簡介348
一、核酸類藥物與基因治療348
二、核酸類藥物的現(xiàn)狀和前景349
三、核酸類藥物遞送載體研究現(xiàn)狀350
四、病毒樣顆粒作為核酸類藥物遞送載體352
第二節(jié)病毒樣顆粒遞送核酸的機理和方法353
一、病毒樣顆粒遞送核酸的機理353
二、病毒樣顆粒遞送核酸的方法356
第三節(jié)病毒樣顆粒遞送DNA的研究進展357
一、病毒樣顆粒遞送DNA的研究358
二、病毒樣顆粒遞送DNA在人類病毒中的應(yīng)用360
第四節(jié)病毒樣顆粒遞送RNA的研究進展365
一、病毒樣顆粒遞送RNA在人和動物中的應(yīng)用365
二、病毒樣顆粒遞送RNA在植物中的應(yīng)用367
三、病毒樣顆粒遞送基因短片段的研究367
第五節(jié)展望與不足371
參考文獻372
第十三章病毒及病毒樣顆粒作為新型功能納米元/器件375
**節(jié)病毒及病毒樣顆粒與量子點375
一、量子點概述375
二、病毒及病毒樣顆粒-量子點復(fù)合物378
三、病毒及病毒樣顆粒-量子點復(fù)合物的研究進展379
第二節(jié)病毒及病毒樣顆粒與金納米顆粒385
一、金納米顆粒概述385
二、病毒及病毒樣顆粒-金納米顆粒復(fù)合物的研究進展385
第三節(jié)病毒及病毒樣顆粒在磁共振成像中的應(yīng)用394
一、磁共振成像概述394
二、VNP/VLP與T1造影劑397
三、VNP/VLP與T2造影劑400
第四節(jié)病毒樣顆粒與多模態(tài)成像404
一、多模態(tài)成像概述404
二、VNP/VLP在多模態(tài)成像中的應(yīng)用406
三、展望410
參考文獻410
第十四章病毒樣顆粒在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用413
**節(jié)病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)解析413
一、戊型肝炎病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)413
二、尼帕病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)415
三、β-諾達病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)416
四、豬圓環(huán)病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)418
五、柯薩奇B3病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)419
六、展望420
第二節(jié)病毒樣顆粒的組裝機制研究421
一、靜電作用力421
二、滲透壓422
三、核酸片段423
四、溫度和pH425
五、熱休克蛋白426
六、谷胱甘肽426
七、展望427
第三節(jié)病毒樣顆粒模擬病毒的研究427
一、病毒樣顆粒模擬病毒的生命周期428
二、病毒樣顆粒模擬病毒的組織嗜性429
三、病毒樣顆粒模擬病毒活化免疫應(yīng)答430
四、展望433
參考文獻433
**章緒論1
**節(jié)病毒樣顆粒的概念及特點1
一、病毒樣顆粒的概念1
二、病毒樣顆粒的特點及優(yōu)勢1
三、病毒樣顆粒的不足2
第二節(jié)病毒樣顆粒的分類3
第三節(jié)病毒樣顆粒的發(fā)展歷程3
一、病毒樣顆粒技術(shù)的進展3
二、病毒樣顆粒相關(guān)表達系統(tǒng)的發(fā)展4
三、病毒樣顆粒組裝技術(shù)的發(fā)展5
參考文獻6
第二章桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)9
**節(jié)概述9
一、桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)點9
二、桿狀病毒載體9
三、宿主11
四、外源基因的表達13
第二節(jié)桿狀病毒-昆蟲細胞表達技術(shù)13
一、桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)的發(fā)展13
二、高效表達策略15
第三節(jié)Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)的VLP制備17
一、載體的選擇17
二、目的基因的克隆21
三、培養(yǎng)昆蟲細胞21
四、重組bacmid的構(gòu)建21
五、使用PCR分析重組質(zhì)粒22
六、VLP的制備23
第四節(jié)桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)在VLP研究中的進展24
一、無囊膜病毒26
二、囊膜病毒28
三、瓶頸和問題30
四、展望34
五、附錄34
參考文獻41
第三章酵母表達系統(tǒng)44
**節(jié)概述44
一、酵母表達系統(tǒng)簡介44
二、常用酵母表達系統(tǒng)分類47
第二節(jié)酵母表達技術(shù)55
一、酵母表達技術(shù)概述55
二、酵母表達技術(shù)的高效表達策略56
第三節(jié)酵母表達系統(tǒng)在VLP研究中的進展61
一、概述61
二、酵母表達系統(tǒng)在人源病毒VLP中的研究62
三、酵母表達系統(tǒng)在動物病毒VLP中的研究65
第四節(jié)展望68
參考文獻69
第四章活病毒載體表達系統(tǒng)74
**節(jié)痘病毒表達系統(tǒng)74
一、痘病毒的分類74
二、痘病毒基因組特點74
三、痘病毒表達載體及其應(yīng)用75
第二節(jié)腺病毒表達系統(tǒng)80
一、腺病毒生物學(xué)特點80
二、腺病毒的分類81
三、腺病毒感染及免疫應(yīng)答機制83
四、重組腺病毒的構(gòu)建85
五、腺病毒表達系統(tǒng)在VLP研究中的進展85
第三節(jié)腺相關(guān)病毒表達系統(tǒng)86
一、腺相關(guān)病毒病原學(xué)特點87
二、腺相關(guān)病毒衣殼組裝87
三、腺相關(guān)病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答88
四、重組腺相關(guān)病毒制備89
五、腺相關(guān)病毒遞送系統(tǒng)的應(yīng)用92
六、腺相關(guān)病毒遞送系統(tǒng)發(fā)展展望94
第四節(jié)慢病毒表達系統(tǒng)94
一、慢病毒表達系統(tǒng)概述95
二、重組慢病毒制備與生產(chǎn)97
三、慢病毒表達系統(tǒng)的應(yīng)用101
四、慢病毒載體系統(tǒng)發(fā)展展望103
五、附錄103
參考文獻105
第五章哺乳動物細胞表達系統(tǒng)108
**節(jié)CHO細胞表達系統(tǒng)108
一、CHO細胞表達載體特征111
二、宿主細胞的優(yōu)化113
三、真核表達載體轉(zhuǎn)染技術(shù)113
四、哺乳動物細胞培養(yǎng)條件115
五、CHO制備VLP研究的進展116
第二節(jié)HEK293細胞表達系統(tǒng)119
一、HEK293細胞系發(fā)展歷史119
二、HEK293細胞表達載體特征121
三、HEK293生產(chǎn)蛋白質(zhì)制劑的優(yōu)點122
四、HEK293真核表達載體的轉(zhuǎn)染123
五、HEK293細胞制備VLP的研究進展123
第三節(jié)細胞培養(yǎng)工藝研究129
一、細胞培養(yǎng)環(huán)境的控制129
二、生物反應(yīng)器130
三、動物細胞流加培養(yǎng)工藝131
四、流加培養(yǎng)的細胞代謝及其基因調(diào)控132
第四節(jié)穩(wěn)定表達重組蛋白的哺乳動物細胞系133
一、利用綠色熒光蛋白（GFP）構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系134
二、利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系135
三、利用噬菌體φC31整合酶構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系135
四、利用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系136
五、問題136
第五節(jié)展望136
參考文獻137
第六章植物表達系統(tǒng)140
**節(jié)植物表達系統(tǒng)概述140
一、植物表達系統(tǒng)的組成140
二、植物表達系統(tǒng)種類142
第二節(jié)植物表達系統(tǒng)表達技術(shù)143
一、植物表達系統(tǒng)常用載體及工程菌株143
二、提高目的蛋白表達水平的手段146
三、植物表達系統(tǒng)表達重組蛋白純化工藝149
第三節(jié)植物表達系統(tǒng)在VLP中的研究進展151
一、囊膜病毒153
二、無囊膜病毒159
第四節(jié)展望162
參考文獻163
第七章原核表達系統(tǒng)166
**節(jié)大腸桿菌表達系統(tǒng)概述及技術(shù)166
一、大腸桿菌表達系統(tǒng)的組成166
二、大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達的策略169
三、VLP在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達與組裝173
第二節(jié)其他原核表達系統(tǒng)（乳酸菌、鏈霉菌）概述及技術(shù)174
一、乳酸菌175
二、鏈霉菌179
第三節(jié)原核表達系統(tǒng)在VLP中的研究進展181
一、囊膜病毒181
二、無囊膜病毒184
第四節(jié)展望189
參考文獻190
第八章無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)195
**節(jié)無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)發(fā)展史195
第二節(jié)無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的優(yōu)點和不足197
一、CFPS的優(yōu)點197
二、CFPS存在的問題197
第三節(jié)無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)分類及研究進展198
一、細胞提取物來源CFPS199
二、“PURE”系統(tǒng)CFPS203
三、CFPS的生產(chǎn)方式204
第四節(jié)CFPS的主要應(yīng)用領(lǐng)域205
一、特殊蛋白質(zhì)的合成205
二、蛋白質(zhì)高通量表達和篩選206
三、合成藥物207
第五節(jié)CFPS在VLP制備中的研究進展207
一、無囊膜病毒207
二、囊膜病毒209
第六節(jié)展望212
參考文獻212
第九章病毒樣顆粒的表征技術(shù)215
**節(jié)概述215
第二節(jié)生物化學(xué)分析技術(shù)216
一、MS技術(shù)216
二、SDS-PAGE技術(shù)218
三、RP-HPLC技術(shù)219
第三節(jié)生物物理學(xué)分析技術(shù)220
一、TEM220
二、Cryo-EM221
三、AFM222
四、DLS技術(shù)224
五、圓盤離心技術(shù)225
六、ES-DMA技術(shù)226
七、AF4技術(shù)227
八、Native-PAGE技術(shù)229
九、密度梯度離心技術(shù)229
十、AUC技術(shù)232
第四節(jié)免疫生物學(xué)分析技術(shù)234
一、ELISA技術(shù)234
二、SPR技術(shù)235
參考文獻237
第十章動物病毒樣顆粒疫苗241
**節(jié)VLP疫苗概述241
一、VLP疫苗的優(yōu)勢241
二、VLP疫苗的多樣性242
三、VLP疫苗的應(yīng)用246
四、VLP疫苗的分類249
五、展望251
第二節(jié)VLP的免疫機制251
一、抗原呈遞細胞的種類、功能251
二、抗原呈遞細胞在VLP疫苗免疫中的作用254
三、B細胞及VLP誘導(dǎo)的B細胞免疫應(yīng)答255
四、主要組織相容性復(fù)合體257
五、抗原呈遞途徑258
六、T細胞及VLP誘導(dǎo)的T細胞免疫應(yīng)答259
第三節(jié)VLP疫苗的研究261
一、人類與人畜共患病VLP疫苗262
二、豬的VLP疫苗274
三、反芻動物的VLP疫苗279
四、禽類的VLP疫苗282
五、兔、魚、犬、貂和貓的VLP疫苗287
參考文獻292
第十一章病毒及病毒樣顆粒作為納米藥物遞送載體305
**節(jié)納米藥物遞送系統(tǒng)概述305
一、納米藥物遞送系統(tǒng)305
二、常見納米藥物遞送載體的分類及特性311
三、病毒及病毒樣顆粒類納米藥物遞送載體314
第二節(jié)病毒及病毒樣顆粒承載藥物的機制和原理316
一、從材料學(xué)與化學(xué)的角度看VNP/VLP316
二、VNP/VLP的解離-自組裝特性317
三、物理吸附法317
四、化學(xué)修飾法318
第三節(jié)病毒及病毒樣顆粒作為納米藥物遞送載體的研究進展322
一、植物VNP/VLP作為納米藥物遞送載體322
二、人/動物VNP/VLP作為納米藥物遞送載體334
三、噬菌體VNP/VLP作為納米藥物遞送載體340
四、展望345
參考文獻345
第十二章病毒樣顆粒作為核酸的遞送載體348
**節(jié)核酸類藥物簡介348
一、核酸類藥物與基因治療348
二、核酸類藥物的現(xiàn)狀和前景349
三、核酸類藥物遞送載體研究現(xiàn)狀350
四、病毒樣顆粒作為核酸類藥物遞送載體352
第二節(jié)病毒樣顆粒遞送核酸的機理和方法353
一、病毒樣顆粒遞送核酸的機理353
二、病毒樣顆粒遞送核酸的方法356
第三節(jié)病毒樣顆粒遞送DNA的研究進展357
一、病毒樣顆粒遞送DNA的研究358
二、病毒樣顆粒遞送DNA在人類病毒中的應(yīng)用360
第四節(jié)病毒樣顆粒遞送RNA的研究進展365
一、病毒樣顆粒遞送RNA在人和動物中的應(yīng)用365
二、病毒樣顆粒遞送RNA在植物中的應(yīng)用367
三、病毒樣顆粒遞送基因短片段的研究367
第五節(jié)展望與不足371
參考文獻372
第十三章病毒及病毒樣顆粒作為新型功能納米元/器件375
**節(jié)病毒及病毒樣顆粒與量子點375
一、量子點概述375
二、病毒及病毒樣顆粒-量子點復(fù)合物378
三、病毒及病毒樣顆粒-量子點復(fù)合物的研究進展379
第二節(jié)病毒及病毒樣顆粒與金納米顆粒385
一、金納米顆粒概述385
二、病毒及病毒樣顆粒-金納米顆粒復(fù)合物的研究進展385
第三節(jié)病毒及病毒樣顆粒在磁共振成像中的應(yīng)用394
一、磁共振成像概述394
二、VNP/VLP與T1造影劑397
三、VNP/VLP與T2造影劑400
第四節(jié)病毒樣顆粒與多模態(tài)成像404
一、多模態(tài)成像概述404
二、VNP/VLP在多模態(tài)成像中的應(yīng)用406
三、展望410
參考文獻410
第十四章病毒樣顆粒在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用413
**節(jié)病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)解析413
一、戊型肝炎病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)413
二、尼帕病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)415
三、β-諾達病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)416
四、豬圓環(huán)病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)418
五、柯薩奇B3病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)419
六、展望420
第二節(jié)病毒樣顆粒的組裝機制研究421
一、靜電作用力421
二、滲透壓422
三、核酸片段423
四、溫度和pH425
五、熱休克蛋白426
六、谷胱甘肽426
七、展望427
第三節(jié)病毒樣顆粒模擬病毒的研究427
一、病毒樣顆粒模擬病毒的生命周期428
二、病毒樣顆粒模擬病毒的組織嗜性429
三、病毒樣顆粒模擬病毒活化免疫應(yīng)答430
四、展望433
參考文獻433
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動物病毒樣顆粒技術(shù) 節(jié)選
**章緒論 **節(jié)病毒樣顆粒的概念及特點 一、病毒樣顆粒的概念 病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP），廣義上是指其在形態(tài)和粒子大小上與真正病毒粒子相同或相似；限于當(dāng)時的研究水平，還無法進一步驗證、分析其具體成分和特性，對這一類結(jié)構(gòu)，統(tǒng)稱為“病毒樣顆粒”（Feller and Chopra，1968；Jokelainen et al.，1970）。目前，VLP多指含有某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，不含有病毒核酸，俗稱偽病毒顆粒或假病毒顆粒（Fuenmayor et al.，2017）。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，利用非共價作用或共價作用修飾所獲得的嵌合型 VLP，均屬于病毒樣顆粒的范疇。 二、病毒樣顆粒的特點及優(yōu)勢 （1）VLP疫苗是近年來新出現(xiàn)的一種基因工程亞單位疫苗形式，其優(yōu)點包括不含核酸，不能自主復(fù)制，安全性好，因此可成為更安全、更經(jīng)濟的候選疫苗。 VLP形式的亞單位疫苗可以避免活病毒來源的或滅活疫苗所導(dǎo)致的潛在危險性，如人類免疫缺陷病毒（HIV）疫苗、人乳頭狀瘤病毒（HPV）疫苗，因此，具有更高的安全性。 （2）與單個蛋白質(zhì)或肽相比， VLP的構(gòu)象表位與天然病毒更相似，因此，可以顯著地提高免疫應(yīng)答水平。由于其表面的結(jié)構(gòu)分子高度重復(fù)， VLP能夠通過有效地交聯(lián) B細胞上的特異性受體，在沒有佐劑的情況下誘導(dǎo)強烈的 B細胞免疫應(yīng)答（Chackerian et al.，2002）。VLP可以模擬病毒的天然結(jié)構(gòu)而使構(gòu)象依賴型抗原表位得以正確呈現(xiàn)，具有良好的免疫原性；與傳統(tǒng)的亞單位疫苗相比，VLP能像真實病毒粒子一樣進入細胞，從而誘導(dǎo)有效細胞免疫應(yīng)答（Greenstone et al.，1998；Sedlik et al.，1997）。甚至可以在較低劑量的情況下，即可誘導(dǎo)較強的免疫應(yīng)答水平，從而顯著降低疫苗成本。 （3）在不影響 VLP結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可以根據(jù)需要插入或刪除某些氨基酸序列，對其進行人工改造，構(gòu)建嵌合 VLP（Cuburu and Chackerian，2011；Kaufmann et al.，2001）。如果把自然病毒粒子中具有免疫抑制功能的特定蛋白分子剔除于 VLP組成之外，可以顯著增強該類疫苗的免疫效力。可以為實現(xiàn)多價和 /或多種病毒抗原的同時免疫，構(gòu)建多價或多聯(lián)疫苗，實現(xiàn)一針多防的目的（Chu et al.，2016；Jennings and Bachmann，2008），如利用豬細小病毒 VP2蛋白與瘧原蟲 CS蛋白上的 CD8+T細胞表位共表達（Rodriguez et al.，2012），利用乙型肝炎核心抗原展示Ⅱ型登革熱病毒的囊膜蛋白 E Ⅲ區(qū)（ED3）（Arora et al.，2012）等，構(gòu)建嵌合 VLP。 （4）可以利用 VLP作為某些小分子或者藥物遞送的載體（Kim et al.，2019；Pretto and van Hest，2019；Zdanowicz and Chroboczek，2016），如基于載體遞送病毒樣顆粒 Caspase 8至乳腺癌細胞，可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡并抑制腫瘤生長（Ao et al.，2019）；另外，利用 VLP作為 DNA疫苗（Jin et al.，2007）或者 RNA遞送的載體（Finbloom et al.，2018），可以提高 DNA疫苗的免疫效力或者用于基因治療（Zhitnyuk et al.，2018）。 （5）VLP除了作為疫苗和遞送載體外，還可用于研究病毒蛋白裝配及分子之間相互作用機制的工具（Chambers et al.，1996；Sabapathy et al.，2019；Tsukamoto et al.，2007）。尤其適用于高致病性病原的相關(guān)研究，如埃博拉病毒（Silvestri et al.，2007）、流感病毒（Makarkov et al.，2017）等，研究過程中不依賴于高等級生物安全防護設(shè)施，具有較高的便利性。 （6）在傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)過程中某些具有高致病性的病原（如口蹄疫、高致病性禽流感）需要高等級的生物安全防護設(shè)施，存在著病原逃逸和泄漏的風(fēng)險，生產(chǎn)成本較高。但是在相關(guān) VLP疫苗制備過程中，不需要操作病原，不需要高等級的生物安全防護設(shè)施，一次性投入成本不高。 三、病毒樣顆粒的不足 （1）從某種程度上來說， VLP疫苗仍屬于亞單位疫苗范疇，其分子量和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度低于天然病毒，所以其免疫原性通常會低于天然病毒。 （2）某些 VLP的衣殼蛋白需要翻譯后修飾，需要真核表達系統(tǒng)進行 VLP的生產(chǎn)和制備，所以制造成本相對較高。另外，利用真核表達系統(tǒng)進行 VLP的生產(chǎn)和制備，通常需要較為復(fù)雜的純化步驟，又增加了 VLP疫苗的生產(chǎn)制造成本。 （3）不同表達系統(tǒng)對于相同的 VLP的結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)過程都會造成一定的影響。Zhou等（2006）對在中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）和多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）中產(chǎn)生的重組乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）進行了鑒定，所制備的抗原顆粒的分子量、大小和單體數(shù)均表現(xiàn)出顯著差異。在 CHO細胞中，HBsAg顆粒的分子量為 4.9 kDa，粒徑為 22.1 nm，更接近于天然病毒，同時單體平均數(shù)為 155個；酵母來源的抗原顆粒較小（分子量為 3.0 kDa，粒徑為 18.1 nm），含有較少的單體（n=86）。因此證明，CHO細胞更適合于生產(chǎn)乙型肝炎病毒表面抗原，并推測其應(yīng)具備更好的免疫原性。這些現(xiàn)象也要求在生產(chǎn) VLP疫苗之前，需要對表達系統(tǒng)進行篩選，以此生成具有更好免疫原性的疫苗。 （4）VLP疫苗生產(chǎn)和制備需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)純化及濃縮工藝。例如，實驗證明， CHO中分離的重組 HBsAg顆粒含有糖基化和非糖基化兩種形式（Zhou et al.，2006），為了達到疫苗抗原均質(zhì)化的要求，必須進行下游蛋白質(zhì)純化和濃縮。而酵母來源的 HPV VLP由高度異質(zhì)性的、大小分布不規(guī)則的 VLP組成，因此，也需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)純化工藝來滿足質(zhì)量要求。另外，細胞內(nèi)組裝的 VLP可能含有宿主蛋白或 DNA等雜質(zhì)。污染物的水平不同，可能具有不同的不良生物反應(yīng)，因此需要進一步處理以滿足生物制藥產(chǎn)品的嚴(yán)格要求。此外， VLP本身可能與宿主細胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而在一定程度上污染了 VLP的外部，也因此增加了下游加工的復(fù)雜性。 （5）盡管可以通過與其他病原體的優(yōu)勢抗原表位共表達，構(gòu)建嵌合 VLP，但是外源抗原表位或者抗原肽的長度受到一定限制，否則會干擾或者破壞 VLP的空間構(gòu)象（Pumpens et al.，1995）。另外，由于空間位置的限制，引入的外源抗原肽的正確折疊存在一定的障礙，降低了重組蛋白的活性或免疫效力。 （6）在生產(chǎn)制備具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的 VLP時，制備產(chǎn)物的異質(zhì)性較高，需要復(fù)雜的下游純化工藝才能獲得同質(zhì)性較好的產(chǎn)品。例如，在昆蟲細胞內(nèi)共表達輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白 VP2、VP6和 VP7（很少同時共表達 VP2、VP6、VP4和 VP7四種結(jié)構(gòu)蛋白）構(gòu)建具有三層結(jié)構(gòu)的 VLP時（Istrate et al.，2008），通常同時存在有單層、雙層和三層衣殼的 VLP（Vieira et al.，2005），通常需要較為復(fù)雜的純化步驟去除細胞雜質(zhì)、單層和雙層 VLP，這極大地降低了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，并且增加了制備難度和成本（Mena et al.，2005；Peixoto et al.，2007；Roldao et al.，2012）。 第二節(jié)病毒樣顆粒的分類 基于母本病毒的結(jié)構(gòu)特征， VLP通常可以分為兩大類：無囊膜 VLP和有囊膜 VLP。無囊膜 VLP通常由一個或多個衣殼蛋白自我組裝而成，它們不包含任何宿主細胞成分。某些無囊膜病毒的一個衣殼蛋白單獨表達即可自我裝配成 VLP結(jié)構(gòu)，如人乳頭狀瘤病毒的 L1蛋白（Harro et al.，2001；Hagensee et al.，1993）、豬細小病毒的 VP2蛋白（Gilbert et al.，2006）、豬圓環(huán)病毒的 ORF2蛋白（Wu et al.，2016）的單獨表達即可以裝配成與天然病毒較為相似的 VLP；而口蹄疫病毒、雞傳染性法氏囊病毒等則需要多個結(jié)構(gòu)蛋白的參與才能裝配成 VLP結(jié)構(gòu)。另外，盡管藍舌病病毒、輪狀病毒的 VP2蛋白就可以形成 VLP結(jié)構(gòu)，但是中間層和昀外層衣殼蛋白的參與是形成生物學(xué)活性更好的 VLP所必需的。 相比于無囊膜 VLP，有囊膜 VLP的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，其包含來源于宿主細胞的細胞膜成分。囊膜成分覆蓋于 VLP表面，表現(xiàn)出與天然病毒相似的結(jié)構(gòu)和功能，包括人免疫缺陷病毒（Buonaguro et al.，2013；Delchambre et al.，1989；Gheysen et al.，1989）、流感病毒（Yamshchikov et al.，1995）、乙型肝炎病毒（McAleer et al.，1984）、丙型肝炎病毒（Baumert et al.，1998）、副黏病毒（Park et al.，2014）VLP等。 此外，在無囊膜 VLP和有囊膜 VLP的基礎(chǔ)上，構(gòu)建表達異源抗原表位的重組嵌合 VLP，常用于獲得無法形成 VLP的特殊病毒衣殼蛋白或藥物載體等（Chu et al.，2016； Li et al.，2016；Shen et al.，2013）。例如，利用對稱模型結(jié)合計算機蛋白質(zhì) -蛋白質(zhì)界面設(shè)計的方法，獲得具有四面體和八面體對稱結(jié)構(gòu)的精確蛋白質(zhì)組件，這種組件可攜帶病毒特異的衣殼蛋白或具有免疫優(yōu)勢的抗原蛋白。有報道稱，研究人員通過計算機設(shè)計從自組裝的三聚體構(gòu)架獲得二十面體納米籠，并可嵌合如綠色熒光蛋白（GFP）等高分子量蛋白質(zhì)且保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不僅提高了內(nèi)部體積，而且擴展了嵌合型 VLP作為異源蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)的生物應(yīng)用范圍。 第三節(jié)病毒樣顆粒的發(fā)展歷程 一、病毒樣顆粒技術(shù)的進展 獲得 VLP的方法，可以根據(jù)非嵌合型和嵌合型來簡單分類，對于非嵌合型的 VLP，主要直接將病原衣殼蛋白構(gòu)建于表達載體，并在相應(yīng)的真核或原核表達系統(tǒng)中組裝獲得，或者是在表達系統(tǒng)中表達出衣殼蛋白后，純化蛋白并在緩沖液的環(huán)境中組裝出 VLP，如目前應(yīng)用的豬圓環(huán)病毒 VLP疫苗，以及國內(nèi)已獲得國家一類新獸藥證書的口蹄疫病毒 VLP疫苗。但大多數(shù)病毒的衣殼蛋白或抗原蛋白必須通過不同的方式獲得嵌合型 VLP，以保證獲得比亞單位呈現(xiàn)更多構(gòu)象表位的 VLP疫苗，嵌合的方式包括基因融合及利用 VLP上賴氨酸和抗原上半胱氨酸化學(xué)偶聯(lián)的傳統(tǒng)方式，也包括幾種較新型的嵌合方式，如利用非共價作用的粘貼（stick）法；共價作用的非天然氨基酸生物正交點擊（click）化學(xué)法和 spy tag/spy catcher自發(fā)異肽鍵分子黏合（glue）法。傳統(tǒng)嵌合方法具有挑戰(zhàn)性，特別是對于復(fù)雜的、帶有多種翻譯后修飾的全長抗原分子。就基因融合而言，外殼蛋白氨基酸的末端是昀需要彎曲的部分，因此與 VLP的穩(wěn)定性密切相關(guān)，融合其他外殼蛋白氨基酸的末端可能會使 VLP不穩(wěn)定。融合的外殼蛋白氨基酸末端伸入 VLP的內(nèi)部則不利于誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。環(huán)形的衣殼蛋白亞基可以耐受插入一些短肽，但是在環(huán)形衣殼蛋白亞基中插入一個完整抗原蛋白通常會影響衣殼蛋白亞基和 /或蛋白質(zhì)抗原的折疊。VLP的組裝過程通常是亞穩(wěn)態(tài)，基因融合方法可能會對 VLP的組裝產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。此外，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜、翻譯修飾多樣、構(gòu)象多變、抗原序列容易變異等因素均導(dǎo)致基因融合方法很難有效推進。 新型嵌合方式獲得 VLP的方法統(tǒng)稱模塊化 VLP組裝，是指經(jīng)過多個步驟生成基于 VLP的疫苗，特別是， VLP和抗原分別生成，然后偶聯(lián)。與基因融合相比，模塊化 VLP的組裝增加了一個額外的步驟，因此在理論上
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