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生物化學與分子生物學實驗教程(第2版) 版權信息
- ISBN：9787030686404
- 條形碼：9787030686404 ; 978-7-03-068640-4
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
生物化學與分子生物學實驗教程(第2版) 內容簡介
《生物化學與分子生物學實驗教程》（第2版）是為適應高等醫科院校的實驗教學改革和發展，以注重基本技能、強化學生實踐能力為指導思想，在第1版的基礎上修訂和編寫而成。本教材由基礎性實驗、綜合性實驗和創新設計性實驗三篇構成。實驗內容既有蛋白質、核酸、酶學、糖類、脂類分析，也有生物分子之間的相互作用檢測，還有來源于教師們科研項目的綜合性實驗和創新設計性實驗，有利于培養學生的實踐能力、綜合分析能力。附錄中有常用儀器、技術等中英文詞匯對照表。本教材內容較新穎，體系較完整，不同層次實驗的培養目標有所側重，便于不同層次教學選擇。
生物化學與分子生物學實驗教程(第2版) 目錄
目錄
前言
**篇 基礎性實驗 1
實驗1 蛋白質的呈色反應、沉淀現象觀察及等電點的測定 3
實驗2 蛋白質含量的測定 6
實驗3 蛋白質電泳 16
實驗4 生化指標檢測 20
實驗5 胰島素、腎上腺素對家兔血糖濃度的影響 26
實驗6 酶的特異性及溫度、pH、激活劑、抑制劑對酶活性的影響 28
實驗7 兔肝堿性磷酸酶的分離純化及比活性測定 31
實驗8 質粒DNA的提取、酶切與鑒定 36
實驗9 真核細胞基因組DNA的提取、定量和純度測定 39
實驗10 PCR擴增G6PD基因外顯子11~12片段 41
第二篇 綜合性實驗 43
實驗11 血清蛋白的鹽析及清/球比值的測定 45
實驗12 丙二酸對琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制作用 48
實驗13 血清蛋白質醋酸纖維素薄膜電泳分離及定量測定 50
實驗14 動脈硬化指數的計算 54
實驗15 紅細胞葡糖-6-磷酸脫氫酶活性測定及家系分析 56
實驗16 針刺“足三里”穴對家兔血糖濃度雙向調節作用的觀察 60
實驗17 人血漿同型半胱氨酸的測定（ELISA方法） 62
實驗18 pMD19-G6PD重組子的藍白斑篩選及酶切鑒定 64
實驗19 SDS-PAGE測定蛋白質的表觀分子質量 68
實驗20 血紅蛋白的等電聚焦分離及其等電點測定 72
實驗21 小鼠肝細胞核的分離、純化與鑒定 77
實驗22 醋酸纖維薄膜電泳技術分離乳酸脫氫酶同工酶 80
實驗23 糖的硅膠G薄層層析分析鑒定 83
實驗24 pThioHis（A）-G6PD重組表達質粒的鑒定 86
實驗25 G6PD重組酶的誘導表達、分離及比活性測定 89
實驗26 ATP、ADP和NADPH對G6PD酶促反應的影響 93
實驗27 小鼠肝組織總RNA提取與RT-PCR獲取真核基因片段 99
實驗28 pET-32a（＋）-G6PD重組表達質粒的構建與鑒定 104
實驗29 小鼠G6PD的6His融合蛋白在大腸桿菌中的表達和純化 110
實驗30 6His-G6PD融合蛋白的Western Blot分析 117
實驗31 免疫共沉淀G6PD相互作用蛋白質 121
實驗32 G6PD表觀Km值及比活性測定 125
實驗33 IEF檢測與G6PD相互作用的蛋白質等電點 128
實驗34 SDS-PAGE分析與G6PD相互作用的免疫共沉淀產物 131
第三篇 創新設計性實驗 135
實驗35 小鼠PKCε相互作用蛋白質的捕獲、鑒定 137
實驗36 小鼠肝臟總蛋白質的雙向電泳分離 140
實驗37 HL-60細胞中DAPK基因甲基化狀態的檢測 144
實驗38 胰島素促進HepG2細胞對葡萄糖吸收的檢測 147
實驗39 氧化應激指標（ROS）的分析 150
實驗40 siRNA干擾人腎癌細胞G6PD表達 152
實驗41 雙熒光素酶報告實驗檢測轉錄因子對G6PD基因的轉錄調控 155
實驗42 乙醛脫氫酶基因突變檢測的實驗設計 158
實驗43 自毀容貌綜合征生化與分子基礎探討的實驗設計 159
實驗44 G6PD缺陷診斷及其分子基礎探討的實驗設計 160
實驗45 黑色素瘤細胞穩定過表達人G6PD基因的實驗設計 161
參考文獻 162
附錄一 生物化學與分子生物學常用數據庫和軟件 164
附錄二 生物化學與分子生物學常用試劑和培養基的配制方法 166
附錄三 生物化學及分子生物學實驗常用縮略語 169
附錄四 生物化學與分子生物學實驗常用詞中英文對照 172
前言
**篇 基礎性實驗 1
實驗1 蛋白質的呈色反應、沉淀現象觀察及等電點的測定 3
實驗2 蛋白質含量的測定 6
實驗3 蛋白質電泳 16
實驗4 生化指標檢測 20
實驗5 胰島素、腎上腺素對家兔血糖濃度的影響 26
實驗6 酶的特異性及溫度、pH、激活劑、抑制劑對酶活性的影響 28
實驗7 兔肝堿性磷酸酶的分離純化及比活性測定 31
實驗8 質粒DNA的提取、酶切與鑒定 36
實驗9 真核細胞基因組DNA的提取、定量和純度測定 39
實驗10 PCR擴增G6PD基因外顯子11~12片段 41
第二篇 綜合性實驗 43
實驗11 血清蛋白的鹽析及清/球比值的測定 45
實驗12 丙二酸對琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制作用 48
實驗13 血清蛋白質醋酸纖維素薄膜電泳分離及定量測定 50
實驗14 動脈硬化指數的計算 54
實驗15 紅細胞葡糖-6-磷酸脫氫酶活性測定及家系分析 56
實驗16 針刺“足三里”穴對家兔血糖濃度雙向調節作用的觀察 60
實驗17 人血漿同型半胱氨酸的測定（ELISA方法） 62
實驗18 pMD19-G6PD重組子的藍白斑篩選及酶切鑒定 64
實驗19 SDS-PAGE測定蛋白質的表觀分子質量 68
實驗20 血紅蛋白的等電聚焦分離及其等電點測定 72
實驗21 小鼠肝細胞核的分離、純化與鑒定 77
實驗22 醋酸纖維薄膜電泳技術分離乳酸脫氫酶同工酶 80
實驗23 糖的硅膠G薄層層析分析鑒定 83
實驗24 pThioHis（A）-G6PD重組表達質粒的鑒定 86
實驗25 G6PD重組酶的誘導表達、分離及比活性測定 89
實驗26 ATP、ADP和NADPH對G6PD酶促反應的影響 93
實驗27 小鼠肝組織總RNA提取與RT-PCR獲取真核基因片段 99
實驗28 pET-32a（＋）-G6PD重組表達質粒的構建與鑒定 104
實驗29 小鼠G6PD的6His融合蛋白在大腸桿菌中的表達和純化 110
實驗30 6His-G6PD融合蛋白的Western Blot分析 117
實驗31 免疫共沉淀G6PD相互作用蛋白質 121
實驗32 G6PD表觀Km值及比活性測定 125
實驗33 IEF檢測與G6PD相互作用的蛋白質等電點 128
實驗34 SDS-PAGE分析與G6PD相互作用的免疫共沉淀產物 131
第三篇 創新設計性實驗 135
實驗35 小鼠PKCε相互作用蛋白質的捕獲、鑒定 137
實驗36 小鼠肝臟總蛋白質的雙向電泳分離 140
實驗37 HL-60細胞中DAPK基因甲基化狀態的檢測 144
實驗38 胰島素促進HepG2細胞對葡萄糖吸收的檢測 147
實驗39 氧化應激指標（ROS）的分析 150
實驗40 siRNA干擾人腎癌細胞G6PD表達 152
實驗41 雙熒光素酶報告實驗檢測轉錄因子對G6PD基因的轉錄調控 155
實驗42 乙醛脫氫酶基因突變檢測的實驗設計 158
實驗43 自毀容貌綜合征生化與分子基礎探討的實驗設計 159
實驗44 G6PD缺陷診斷及其分子基礎探討的實驗設計 160
實驗45 黑色素瘤細胞穩定過表達人G6PD基因的實驗設計 161
參考文獻 162
附錄一 生物化學與分子生物學常用數據庫和軟件 164
附錄二 生物化學與分子生物學常用試劑和培養基的配制方法 166
附錄三 生物化學及分子生物學實驗常用縮略語 169
附錄四 生物化學與分子生物學實驗常用詞中英文對照 172
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生物化學與分子生物學實驗教程(第2版) 節選
**篇基礎性實驗 經過長期實驗教學實踐證明，這一部分收錄的10個基礎性實驗有利于鞏固學生的生物化學與分子生物學基本理論知識，有助于培養學生的基本實驗操作技能。根據醫學生物化學與分子生物學教學的邏輯和規律，實驗教學內容按物質分類編排，實驗1~實驗3是有關蛋白質定性、定量檢測與分離技術，實驗4~實驗5是關于血液生化指標檢測，實驗6~實驗7是酶學相關實驗，實驗8~實驗10則涉及DNA提取與基因擴增技術。這些基礎性實驗幾乎涉及了大部分生物化學與分子生物學的基本技術，例如分光技術、電泳技術、離心技術以及PCR技術等，是醫科院校本科實驗教學的重要組成部分。 實驗1 蛋白質的呈色反應、沉淀現象觀察及等電點的測定 【實驗目的】 1．能夠闡述蛋白質等電點的概念、鹽析法沉淀蛋白質的基本原理。 2．能夠利用沉淀現象分析引起蛋白質沉淀的因素。 【實驗原理】 將尿素加熱至180 ℃左右，兩分子尿素脫去一分子氨縮合成雙縮脲，在堿性溶液中，雙縮脲與硫酸銅結合，生成紫色或紫紅色的復合物，此即雙縮脲反應。凡含有兩個以上肽鍵的化合物，都能發生雙縮脲反應，故一切蛋白質及二肽以上的物質都有此反應。 凡是含有自由氨基的化合物，如蛋白質、多肽、各種氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸除外）以及其他伯胺化合物（包括氨），與茚三酮的水合物共熱時，可生成紫藍色的化合物。 維持蛋白質膠體溶液穩定的因素主要是同種電荷和水化膜。當這兩個因素遭破壞后，蛋白質分子顆粒就發生聚集并析出沉淀。能使蛋白質沉淀的化學試劑主要有：中性鹽類、某些有機溶劑、重金屬鹽類及生物堿試劑等。向蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽時，蛋白質從溶液中沉淀析出，此即為是鹽析。 蛋白質分子在酸性或堿性環境中，帶有正電荷或負電荷，互相排斥，不易形成沉淀，在等電點時，由于失去同種電荷相互排斥的作用，很容易形成沉淀。體內各種蛋白質的等電點不同，但大多數蛋白質的等電點接近于pH 5.0。 蛋白質分子在大于等電點的pH溶液中，與帶有正電荷的重金屬離子結合，即形成不再溶解的沉淀。重金屬鹽類沉淀蛋白質，能引起蛋白質變性，而中性鹽類即使加入量很多也不改變蛋白質原有的性質。 生物堿是植物中具有顯著生理作用的一類含氮的堿性有機物質。凡能夠使生物堿沉淀，或能與生物堿作用而呈色的物質，稱為生物堿試劑，主要有：磷鎢酸、苦味酸、鞣酸等。蛋白質在小于等電點的 pH溶液中，能與生物堿試劑中的負離子結合而形成沉淀，此沉淀通常可在堿性溶液中再溶解。蛋白質能與沉淀生物堿的試劑作用而產生沉淀，可能是由于蛋白質含有與生物堿相似的含氮基團。 所有蛋白質都可因為高溫加熱破壞了其分子內部的化學鍵而變性、凝固。溶液中的蛋白質在過酸或過堿環境中容易變性，此時若溫度升高，蛋白質雖變性但不產生沉淀，冷卻后，調節溶液的pH到等電點時，則有沉淀析出。 【實驗器材與試劑】 1．實驗器材 移液器、電爐或電磁爐、恒溫水浴箱、濾紙、Φ50 mm 漏斗、10 mL量杯、刻度吸量管。 2．試劑 10%卵清蛋白溶液、10%NaOH溶液、10%HCl溶液、1%CuSO4溶液、尿素、0.1%茚三酮乙醇液、0.25%丙氨酸溶液、0.5%NaOH溶液、0.5%ZnSO4溶液、飽和（NH4）2SO4溶液、10%磺基水楊酸溶液、1%乙酸溶液、10%乙酸溶液、0.5%酪蛋白的乙酸鈉溶液（稱取純酪蛋白0.5 g，置于100 mL容量瓶內，加蒸餾水40 mL、1 mol/L NaOH溶液10 mL后搖勻，使酪蛋白溶解后再加入1 mol/L乙酸10 mL，*后用蒸餾水稀釋至刻度）。 【實驗步驟】 1．蛋白質的呈色反應 （1）雙縮脲反應 ①取試管1支，加入10%卵清蛋白溶液0.1 mL、10%NaOH溶液0.25 mL及1%CuSO4溶液0.1 mL，混勻后，觀察試管中的溶液呈現出什么現象？記錄并解釋。 ②另取試管1支，加入尿素0.5 g，加熱使尿素熔化，此時可嗅到什么氣味？繼續加熱使之凝固，該固體為何物？加入蒸餾水2 mL使固體溶解，再加入10%NaOH溶液0.25 mL、1%CuSO4溶液0.1 mL，試管中的溶液呈現出什么現象？記錄并解釋。 （2）茚三酮反應 ①取試管1支，加入10%卵清蛋白溶液0.2 mL、蒸餾水0.5 mL及0.1%茚三酮乙醇液0.3 mL，混勻后置于沸水浴中加熱，1 min后取出。觀察試管中溶液呈現出什么顏色，冷卻后有何變化？ ②另取試管1支，加入0.25%丙氨酸溶液0.2 mL、蒸餾水0.5 mL及0.1%茚三酮乙醇液0.3 mL，混勻后置于沸水浴中加熱，1 min后取出。觀察試管中溶液呈現出什么顏色，冷卻以后有何變化？ 2．蛋白質的沉淀反應 （1）蛋白質的鹽析 ①取試管1支，加入10%卵清蛋白溶液5 mL、飽和（NH4）2SO4溶液5 mL，混勻，靜置20 min后則球蛋白全部析出沉淀。將靜置后的液體過濾，收集過濾后的透明液（濾液中含有清蛋白）。若濾液渾濁須重復過濾至透明為止。 ②另取試管1支，加入上述清濾液1 mL、固體（NH4）2SO4 0.5 g，搖動試管至溶液出現混濁。再向渾濁溶液［不含（NH4）2SO4結晶顆粒］中加入蒸餾水2.0 mL，搖勻，記錄結果并解釋。 （2）重金屬鹽類沉淀蛋白質 取試管1支，加入10%卵清蛋白溶液1 mL和0.5%NaOH溶液50 μL，混勻。再加入0.5%ZnSO4溶液0.3 mL，記錄結果并解釋。 （3）生物堿試劑沉淀蛋白質 ①取試管1支，加入10%卵清蛋白溶液1 mL、10%HCl溶液50 μL，混勻。再加入10%磺基水楊酸溶液0.2 mL，混勻，記錄結果。 ②另取試管1支，加入10%卵清蛋白溶液1 mL、10%NaOH溶液0.3 mL，混勻。再加入10%磺基水楊酸溶液0.2 mL，混勻，記錄結果。 ③比較兩支試管中溶液的變化，并解釋原因。 （4）加熱沉淀蛋白質 ①取試管4支，編號后按表1-1加入試劑： 表1-1 加熱沉淀蛋白質反應體系配制 ②將4支試管同時放入沸水浴中，1 min后取出，記錄現象，并解釋原因。 ③冷卻后，向第3支試管中緩慢加入10%NaOH溶液，每次30 μL，邊加邊搖動試管，觀察現象并記錄所加NaOH溶液的量。 ④向第4支試管中緩慢加入10%乙酸溶液，每次0.2 mL，邊加邊搖動試管，觀察現象并記錄所加乙酸溶液的量。 3．蛋白質等電點的測定 （1）取直徑相同的試管5支，編號后按表1-2準確加入試劑。 表1-2 蛋白質等電點測定的反應體系配制 （2）向各管中加入酪蛋白的乙酸鈉溶液l mL，邊加邊搖（切勿在各管都加完后才搖），靜置10~30 min后，分別比較各管的渾濁度，并用（＋）符號表示。沉淀*多而上清液透明管的溶液pH即為酪蛋白的等電點。記錄其等電點。 【注意事項】 等電點的測定時，在向各管中加入酪蛋白的乙酸鈉溶液l mL時，邊加邊搖，切勿在各管都加完后才搖動試管。靜置后觀察渾濁度時，不能搖晃試管。 【思考題】 1．什么是蛋白質的兩性解離及等電點？引起蛋白質沉淀的主要因素有哪些？ 2．是不是只要發生雙縮脲反應就一定有蛋白質存在？氨基酸能不能發生雙縮脲反應？ （吳冠儒） 實驗2 蛋白質含量的測定 蛋白質含量的測定方法很多，各有優缺點，本實驗主要介紹了雙縮脲法、考馬斯亮藍染色法、紫外法的相關實驗操作。 【實驗目的】 1．能夠闡述雙縮脲法、考馬斯亮藍染色法及紫外法測定蛋白質的原理。 2．能夠獨立完成蛋白質定量測定的實驗操作。 一、雙縮脲法測定血清蛋白質含量 【實驗原理】 兩分子脲經180 ℃左右加熱，釋放出一分子氨后，得到雙縮脲（NH3CONHCONH3）。在強堿性條件下，雙縮脲與Cu2＋生成紫紅色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基，或兩個及以上肽鍵的化合物，都能進行雙縮脲反應。紫紅色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子質量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。 本實驗將血清中的總蛋白質，經雙縮脲試劑顯色后，再通過比色測定其含量。 本法測定范圍為1~10 mg蛋白質，優點是快速、干擾物質少，且不同蛋白質顯色相似，缺點是靈敏度差，適用于精度要求不高但需快速測定的樣本。 【實驗器材與試劑】 1．實驗器材 刻度吸量管、洗耳球、試管、可見分光光度計。 2．試劑 （1）稀釋血清：取1 mL血清（人、兔或其他蛋白樣品），置于100 mL容量瓶中，加0.9%NaCl溶液稀釋至刻度（此為稀釋100倍，或根據具體情況酌情稀釋100~300倍）。 （2）雙縮脲試劑（堿性銅試劑）：稱取1.75 g硫酸銅（CuSO4 5H2O）置于1000 mL燒杯中，先加蒸餾水使之溶解，將此溶液移至1000 mL容量瓶中。再加入300 mL濃氨水和200 mL飽和NaOH溶液混勻，以蒸餾水加至1000 mL，置于塑料瓶中避光長期保存，但有沉淀或無氨水氣味則不能再用。 （3）標準蛋白溶液（1 mg/mL）：牛血清白蛋白用 0.9%NaCl溶液溶解、稀釋至終濃度 1 mg/mL，存于冰箱中，可保存一個月。此標準蛋白溶液用以繪制標準曲線及在測定時用作標準對照。 【實驗步驟】 1．標準曲線的繪制 取試管6支，按表2-1操作。
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