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發酵工程實驗教程 版權信息
- ISBN：9787030411136
- 條形碼：9787030411136 ; 978-7-03-041113-6
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
發酵工程實驗教程 內容簡介
本書在多年發酵工程實驗教學基礎上，針對發酵工程國內外發展和發酵工業的近期新狀況以及高教改革方向，有針對性進行實驗內容設計，以驗證、基礎、綜合實驗為架構，融入現代發酵工程中所采取的技術理念，內容包括菌株誘變技術及遺傳改造、重組菌株培養技術、培養條件優化、搖瓶及發酵罐使用及控制技術等方面。全書共分五大部分，由30-40個實驗組成，內容包括發酵微生物學實驗室的設計及要求、發酵微生物菌種的篩選、誘變、工程改造及保藏、發酵設備、搖瓶發酵條件的優化、綜合實驗。
發酵工程實驗教程 目錄
目錄
總序
前言
實驗一 抗真菌的放線菌篩選 1
一、實驗目的 1
二、實驗原理 1
三、實驗材料 2
四、實驗步驟 2
五、實驗結果 5
六、思考題 5
七、參考文獻 6
實驗二 蛋白酶產生菌的篩選 7
一、實驗目的
二、實驗原理 7
三、實驗材料 8
四、實驗步驟 8
五、實驗結果 8
六、思考題 9
七、參考文獻 9
實驗三 海底淤泥中β-半乳糖苷酶產生菌的分離純化 10
一、實驗目的 10
二、實驗原理 10
三、實驗材料 11
四、實驗步驟12
五、實驗結果
六、思考題 15
七、參考文獻 16
實驗四 紫外線誘變 17
一、實驗目的 17
二、實驗原理 17
三、實驗材料 18
四、實驗步驟 18
五、實驗結果 19
六、思考題 19
七、參考文獻 20
實驗五 亞硝基胍誘變 21
一、實驗目的 21
二、實驗原理 21
三、實驗材料 22
四、實驗步驟 22
五、實驗結果 23
六、思考題 23
七、參考文獻 23
實驗六 大腸桿菌表達外源蛋白工程菌的構建 24
一、實驗目的 24
二、實驗原理 24
三、實驗材料 28
四、實驗步驟 28
五、實驗結果 31
六、思考題 3l
七、參考文獻 31
實驗七 畢赤酵母表達酶工程菌株的構建 32
一、實驗目的 32
二、實驗原理 32
三、實驗材料 37
四、實驗步驟 38
五、實驗結果 42
六、思考題 43
七、參考文獻 43
實驗八 發酵微生物菌種的保藏與復壯 44
一、實驗目的 44
二、實驗原理 44
三、實驗材料 46
四、實驗步驟 46
五、實驗結果 49
六、思考題 50
七、參考文獻 50
實驗九 BIOTECH-7BG-2002型發酵罐的構造、原理及其使用方法 51
一、實驗目的 51
二、實驗原理 51
三、實驗材料 52
四、實驗步驟 52
五、實驗結果 54
六、思考題 54
七、參考文獻 54
實驗十 Biostat C 42 D300型發酵罐的使用原理及方法 55
一、實驗目的 55
二、實驗原理 55
三、操作步驟 58
四、思考題 62
五、參考文獻 62
實驗十一 高效液相色譜(HPLC)的原理及使用方法 63
一、實驗目的 63
二、實驗原理 63
三、高效液相色譜在微生物發酵工業中的應用 68
四、思考題 72
五、參考文獻 72
實驗十二 氣相色譜的原理及其在發酵中的應用 73
一、實驗目的 73
二、實驗原理 73
三、氣相色譜在發酵中的應用 74
四、思考題 76
五、參考文獻 76
實驗十三 質譜的原理及其在發酵中的應用 77
一、實驗目的77
二、實驗原理 77
三、質譜技術在發酵工業中的應用 83
四、思考題 86
五、參考文獻 86
實驗十四 碳源種類及濃度對細胞生長及產物積累的影響 88
一、實驗目的 88
二、實驗原理 88
三、實驗材料 89
四、實驗步驟 90
五、思考題 91
六、參考文獻 91
實驗十五 氯源種類及濃度對細胞生長及產物積累的影響 92
一、實驗目的 92
二、實驗原理 92
三、實驗材料 93
四、實驗步驟 93
五、思考題 95
六、參考文獻 95
實驗十六 pH、溫度及轉速對細胞生長及產物積累的影響 96
一、實驗日的 96
二、實驗原理 96
三、實驗材料 97
四、實驗步驟 98
五、實驗結果 99
六、思考題 99
七、參考文獻 99
實驗十七 玉米淀粉的Z醇發酵及Z醇含量測定 100
一、實驗目的 100
二、實驗原理 100
三、實驗材料 102
四、實驗步驟 102
五、實驗結果 104
六、思考題 104
七、參考文獻 104
實驗十八 啤酒釀造 105
一、實驗目的 105
二、實驗原理 105
三、實驗材料 107
四、實驗步驟 108
五、實驗結果 110
六、思考題 110
七、參考文獻 110
實驗十九 果酒釀造 111
一、實驗目的 111
二、實驗原理 111
三、實驗材料 113
四、實驗步驟 113
五、實驗結果 114
六、思考題 114
七、參考文獻 115
實驗二十 固態法白酒的釀造、蒸餾及勾兌 116
一、實驗目的 116
二、實驗原理 116
三、實驗材料 117
四、實驗步驟 117
五、實驗結果 119
六、思考題 120
七、參考文獻 120
實驗二十一 阿維菌素發酵、提取和檢測 121
一、實驗目的 121
二、實驗原理 121
三、實驗材料 123
四、實驗步驟 123
五、實驗結果 125
六、思考題 125
七、參考文獻 125
實驗二十二 鏈霉菌噬菌體的純化和效價測定 126
一、實驗目的 126
二、實驗原理 126
三、實驗材料 128
四、實驗步驟 129
五、實驗結果 129
六、思考題 130
七、參考文獻 130
實驗二十三 四環素的定向發酵、效價測定及提取 131
一、實驗目的 131
二、實驗原理 131
三、實驗材料 133
四、實驗步驟 133
五、實驗結果 135
六、思考題 l35
七、參考文獻 l36
實驗二十四 管碟法檢定四環素的生物效價 l37
一、實驗日的 l37
二、實驗原理 l37
三、實驗材料 l38
四、實驗步驟 l38
五、實驗結果 139
六、思考題 l39
實驗二十五 表達外源蛋白大腸軒菌工程菌的離密度培養 140
一、實驗目的 140
二、實驗原理 140
三、實驗材料 142
四、實驗步驟 142
五、實驗結果 144
六、思考題 144
七、參考文獻 144
實驗二十六 重組畢赤酵母的高密度培養及酶的誘導表達 145
一、實驗目的 145
二、實驗原理 145
三、實驗材料 148
四、實驗步驟 148
五、實驗結果 150
六、思考題 150
七、參考文獻 150
實驗二十七 谷氨酸的發酵及產物提取 152
一、實驗目的 152
二、實驗原理 152
三、實驗材料 154
四、實驗步驟 154
五、實驗結果 155
六、思考題 156
七、參考文獻 156
實驗二十八 檸檬酸的發酵及產物提取 157
一、實驗目的 157
二、實驗原理 157
三、實驗材料 159
四、實驗步驟 159
五、實驗結果 160
六、思考題 161
七、參考文獻 161
實驗二十九 酸乳及乳酸飲料的發酵 162
一、實驗目的 162
二、實驗原理 162
三、實驗材料 163
四、實驗步驟 163
五、實驗結果 165
六、思考題 165
七、參考文獻 165
實驗三十 多聚羧基烷酸的發酵及產物提取 166
一、實驗目的 166
二、實驗原理 166
三、實驗材料 168
四、實驗步驟 168
五、實驗結果 169
六、思考題 170
七、參考文獻 170
實驗三十一 產酸克氏軒菌固氮條件下的發酵培養及固氮酶活性測定 171
一、實驗目的 171
二、實驗原理 171
三、實驗材料 173
四、實驗步驟 173
五、實驗結果 174
六、思考題 174
七、參考文獻 174
實驗三十二 醬油釀造 175
一、實驗目的 175
二、實驗原理 175
三實驗材料 177
四、實驗步驟 177
五、實驗結果 181
六、思考題 181
七、參考文獻 182
實驗三十三 米曲霉培養及蛋白酶的分析 183
一、實驗目的 183
二、實驗原理 183
三、實驗材料 184
四、實驗步驟 184
五、實驗結果 185
六、思考題 186
七、參考文獻 186
實驗三十四 紅曲的發酵及色素提取 187
一、實驗目的 187
二、實驗原理 187
三、實驗材料 190
四、實驗步驟 190
五、實驗結果 191
六、思考題 192
七、參考文獻 192
實驗三十五 香菇菌絲體的固體培養和液體深層培養 193
一、實驗目的 193
二、實驗原理 193
三、實驗材料 195
四、實驗方法 195
五、實驗結果 196
六、思考題 197
七、參考文獻 197
實驗三十六 猴頭菇菌絲體的液體深層培養及猴頭多糖的提取 198
一、實驗目的 198
二、實驗原理 198
三、實驗材料 199
四、實驗方法 200
五、實驗結果 201
六、思考題 202
七、參考文獻 202
附錄Ⅰ 縮略詞表 203
附錄Ⅱ 實驗常用培養基配方及其配制方法 204
附錄Ⅲ 實驗常用試劑的配制 218
總序
前言
實驗一 抗真菌的放線菌篩選 1
一、實驗目的 1
二、實驗原理 1
三、實驗材料 2
四、實驗步驟 2
五、實驗結果 5
六、思考題 5
七、參考文獻 6
實驗二 蛋白酶產生菌的篩選 7
一、實驗目的
二、實驗原理 7
三、實驗材料 8
四、實驗步驟 8
五、實驗結果 8
六、思考題 9
七、參考文獻 9
實驗三 海底淤泥中β-半乳糖苷酶產生菌的分離純化 10
一、實驗目的 10
二、實驗原理 10
三、實驗材料 11
四、實驗步驟12
五、實驗結果
六、思考題 15
七、參考文獻 16
實驗四 紫外線誘變 17
一、實驗目的 17
二、實驗原理 17
三、實驗材料 18
四、實驗步驟 18
五、實驗結果 19
六、思考題 19
七、參考文獻 20
實驗五 亞硝基胍誘變 21
一、實驗目的 21
二、實驗原理 21
三、實驗材料 22
四、實驗步驟 22
五、實驗結果 23
六、思考題 23
七、參考文獻 23
實驗六 大腸桿菌表達外源蛋白工程菌的構建 24
一、實驗目的 24
二、實驗原理 24
三、實驗材料 28
四、實驗步驟 28
五、實驗結果 31
六、思考題 3l
七、參考文獻 31
實驗七 畢赤酵母表達酶工程菌株的構建 32
一、實驗目的 32
二、實驗原理 32
三、實驗材料 37
四、實驗步驟 38
五、實驗結果 42
六、思考題 43
七、參考文獻 43
實驗八 發酵微生物菌種的保藏與復壯 44
一、實驗目的 44
二、實驗原理 44
三、實驗材料 46
四、實驗步驟 46
五、實驗結果 49
六、思考題 50
七、參考文獻 50
實驗九 BIOTECH-7BG-2002型發酵罐的構造、原理及其使用方法 51
一、實驗目的 51
二、實驗原理 51
三、實驗材料 52
四、實驗步驟 52
五、實驗結果 54
六、思考題 54
七、參考文獻 54
實驗十 Biostat C 42 D300型發酵罐的使用原理及方法 55
一、實驗目的 55
二、實驗原理 55
三、操作步驟 58
四、思考題 62
五、參考文獻 62
實驗十一 高效液相色譜(HPLC)的原理及使用方法 63
一、實驗目的 63
二、實驗原理 63
三、高效液相色譜在微生物發酵工業中的應用 68
四、思考題 72
五、參考文獻 72
實驗十二 氣相色譜的原理及其在發酵中的應用 73
一、實驗目的 73
二、實驗原理 73
三、氣相色譜在發酵中的應用 74
四、思考題 76
五、參考文獻 76
實驗十三 質譜的原理及其在發酵中的應用 77
一、實驗目的77
二、實驗原理 77
三、質譜技術在發酵工業中的應用 83
四、思考題 86
五、參考文獻 86
實驗十四 碳源種類及濃度對細胞生長及產物積累的影響 88
一、實驗目的 88
二、實驗原理 88
三、實驗材料 89
四、實驗步驟 90
五、思考題 91
六、參考文獻 91
實驗十五 氯源種類及濃度對細胞生長及產物積累的影響 92
一、實驗目的 92
二、實驗原理 92
三、實驗材料 93
四、實驗步驟 93
五、思考題 95
六、參考文獻 95
實驗十六 pH、溫度及轉速對細胞生長及產物積累的影響 96
一、實驗日的 96
二、實驗原理 96
三、實驗材料 97
四、實驗步驟 98
五、實驗結果 99
六、思考題 99
七、參考文獻 99
實驗十七 玉米淀粉的Z醇發酵及Z醇含量測定 100
一、實驗目的 100
二、實驗原理 100
三、實驗材料 102
四、實驗步驟 102
五、實驗結果 104
六、思考題 104
七、參考文獻 104
實驗十八 啤酒釀造 105
一、實驗目的 105
二、實驗原理 105
三、實驗材料 107
四、實驗步驟 108
五、實驗結果 110
六、思考題 110
七、參考文獻 110
實驗十九 果酒釀造 111
一、實驗目的 111
二、實驗原理 111
三、實驗材料 113
四、實驗步驟 113
五、實驗結果 114
六、思考題 114
七、參考文獻 115
實驗二十 固態法白酒的釀造、蒸餾及勾兌 116
一、實驗目的 116
二、實驗原理 116
三、實驗材料 117
四、實驗步驟 117
五、實驗結果 119
六、思考題 120
七、參考文獻 120
實驗二十一 阿維菌素發酵、提取和檢測 121
一、實驗目的 121
二、實驗原理 121
三、實驗材料 123
四、實驗步驟 123
五、實驗結果 125
六、思考題 125
七、參考文獻 125
實驗二十二 鏈霉菌噬菌體的純化和效價測定 126
一、實驗目的 126
二、實驗原理 126
三、實驗材料 128
四、實驗步驟 129
五、實驗結果 129
六、思考題 130
七、參考文獻 130
實驗二十三 四環素的定向發酵、效價測定及提取 131
一、實驗目的 131
二、實驗原理 131
三、實驗材料 133
四、實驗步驟 133
五、實驗結果 135
六、思考題 l35
七、參考文獻 l36
實驗二十四 管碟法檢定四環素的生物效價 l37
一、實驗日的 l37
二、實驗原理 l37
三、實驗材料 l38
四、實驗步驟 l38
五、實驗結果 139
六、思考題 l39
實驗二十五 表達外源蛋白大腸軒菌工程菌的離密度培養 140
一、實驗目的 140
二、實驗原理 140
三、實驗材料 142
四、實驗步驟 142
五、實驗結果 144
六、思考題 144
七、參考文獻 144
實驗二十六 重組畢赤酵母的高密度培養及酶的誘導表達 145
一、實驗目的 145
二、實驗原理 145
三、實驗材料 148
四、實驗步驟 148
五、實驗結果 150
六、思考題 150
七、參考文獻 150
實驗二十七 谷氨酸的發酵及產物提取 152
一、實驗目的 152
二、實驗原理 152
三、實驗材料 154
四、實驗步驟 154
五、實驗結果 155
六、思考題 156
七、參考文獻 156
實驗二十八 檸檬酸的發酵及產物提取 157
一、實驗目的 157
二、實驗原理 157
三、實驗材料 159
四、實驗步驟 159
五、實驗結果 160
六、思考題 161
七、參考文獻 161
實驗二十九 酸乳及乳酸飲料的發酵 162
一、實驗目的 162
二、實驗原理 162
三、實驗材料 163
四、實驗步驟 163
五、實驗結果 165
六、思考題 165
七、參考文獻 165
實驗三十 多聚羧基烷酸的發酵及產物提取 166
一、實驗目的 166
二、實驗原理 166
三、實驗材料 168
四、實驗步驟 168
五、實驗結果 169
六、思考題 170
七、參考文獻 170
實驗三十一 產酸克氏軒菌固氮條件下的發酵培養及固氮酶活性測定 171
一、實驗目的 171
二、實驗原理 171
三、實驗材料 173
四、實驗步驟 173
五、實驗結果 174
六、思考題 174
七、參考文獻 174
實驗三十二 醬油釀造 175
一、實驗目的 175
二、實驗原理 175
三實驗材料 177
四、實驗步驟 177
五、實驗結果 181
六、思考題 181
七、參考文獻 182
實驗三十三 米曲霉培養及蛋白酶的分析 183
一、實驗目的 183
二、實驗原理 183
三、實驗材料 184
四、實驗步驟 184
五、實驗結果 185
六、思考題 186
七、參考文獻 186
實驗三十四 紅曲的發酵及色素提取 187
一、實驗目的 187
二、實驗原理 187
三、實驗材料 190
四、實驗步驟 190
五、實驗結果 191
六、思考題 192
七、參考文獻 192
實驗三十五 香菇菌絲體的固體培養和液體深層培養 193
一、實驗目的 193
二、實驗原理 193
三、實驗材料 195
四、實驗方法 195
五、實驗結果 196
六、思考題 197
七、參考文獻 197
實驗三十六 猴頭菇菌絲體的液體深層培養及猴頭多糖的提取 198
一、實驗目的 198
二、實驗原理 198
三、實驗材料 199
四、實驗方法 200
五、實驗結果 201
六、思考題 202
七、參考文獻 202
附錄Ⅰ 縮略詞表 203
附錄Ⅱ 實驗常用培養基配方及其配制方法 204
附錄Ⅲ 實驗常用試劑的配制 218
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發酵工程實驗教程 節選
實驗一 抗真菌的放線菌篩選 一、實驗目的 1.了解并掌握平板制作方法和常用的分離純化微生物的基本操作技術。 2.了解并掌握生物防治微生物的平板篩選流程。 二、實驗原理 1.微生物的分離與純化 人類對動植物的認識可以追溯到人類的出現，可是對數量龐大、分布極其廣泛并始終包圍在人體內外的微生物卻長期缺乏認識。直到17世紀中后期，荷蘭人列文虎克（Leeuwehoek）用自制的顯微鏡發現了微生物的存在，人們才開始研究發酵與微生物的關系。19世紀60年代，法國科學家巴斯德（Pasteur）通過實驗證明了酒和醋的釀造過程都是微生物發酵的過程，并提出了巴斯德消毒法。此后，德國人科赫（Koch）發明了純培養技術，利用滅過菌的瓊脂平板，可以分離到由單一菌株形成的單菌落，從而使人們可以利用單一的純種微生物來進行微生物發酵，避免了其他雜菌對發酵過程的干擾。 從混雜的微生物群體中獲得純種微生物的方法主要有以下幾種。 1）簡易單孢子分離法。簡易單孢子分離法是一種可直接在普通顯微鏡下利用低倍鏡分離單孢子的方法。它采用很細的毛細管吸取經適當稀釋的于包子懸浮液，于無菌條件下滴在無菌培養皿蓋的內壁上，每個微滴的面積略小于顯微鏡低倍鏡視野：然后將皿蓋快速翻轉，蓋在平板上，在低倍鏡下逐個檢查微滴；之后于無菌條件下，將一小薄片營養瓊脂片放到只含有一個萌發孢子的微滴上，倒置培養使其發育成單菌落；再將單菌落轉移到培養基斜面或液體培養基中，即可獲得僅由單個袍子發育而成的純培養。 2）平板分離法。該方法操作簡便，適用于多數微生物的分離與純化，其基本原理包括兩方面：一方面，選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養、pH、溫度和氧等，同時也可加入某種抑制其他微生物生長的抑制劑，從而淘汰一些不需要的微生物；另一方面，微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得純培養，獲得單個菌落可通過稀釋涂布法或平板劃線等技術完成。 需要指出的是挑取的單菌落并不一定是純培養，還需要結合顯微鏡檢測個體形態特征后才能確定。有些微生物的純培養要經過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。 2.農作物真菌病害的生物防治 植物病原真菌引起的植物病害是植物的**大病害，每年給糧食生產造成巨大的損失。化學農藥在植物病害防治上發揮了作用，但其殘留與污染環境等問題直接危害了人類的健康及生存，隨著綠色農業和有機果蔬的興起，尋找新的環境友好型病害防治措施開始受到人們的廣泛關注。 生物間的相互關系復雜且多樣。其中的拮抗關系是微生物病害的生物防治基礎。拮抗又稱抗生，是指由某種生物所產生的特定代謝產物可抑制他種生物的生長發育甚至殺死它們的一種相互關系。由拮抗性微生物產生的抑制或殺死他種生物的抗生素，是*典型并且與人類關系*密切的拮抗作用.在眾多的拮抗性微生物產生的抗生素中，有一部分屬于農用抗生素，它們具有高效、安全、廉價和可降解等優點，是農藥發展的重要方向。井岡霉素、阿維菌素、春日；霉素、慶豐霉素和滅瘟素等已在農作物和森林病蟲害防治中發揮了較好的作用。 放線菌是介于細菌與絲狀真菌之間而又接近于細菌的一類絲狀原核生物，多為腐生，少數寄生。放線菌常以孢子或菌絲狀態極其廣泛地存在于自然界中，并以土壤中*多。典型的放線菌有發達的基內菌絲體和可分化成袍子絲的氣生菌絲體，其基內菌絲體可以產生不同的色素，使培養基顏色發生變化。放線菌的孢子絲形態多樣，如直、波曲、鉤狀、螺旋狀和輪生等，是菌種鑒定的重要標志之一.在目前己發現的微生物來源的生物活性物質中，有超過2/3來自放線菌的次級代謝產物，它們在農業生產中具有較高的環境效應和經濟效應，具有廣闊的開發應用前景。 3.放線菌生物防治作用機制 生物防治放線菌主要通過5種作用機制，抑制病原真菌生長：①分泌抗菌活性物質；②分泌纖維素酶、幾丁質酶、葡聚糖酶等胞外酶，破壞病原真菌菌絲體；③分泌植物激素類物質促進農作物生長，改善植株生理生化特性；④通過提高植物保護性誘導酶活性，誘導植株產生系統抗病性，增強植物抗病性及抗逆性；⑤通過根際土壤微生物區系修復調整植株根際土壤微生物生態平衡。 三、實驗材料 1）培養基：高氏1號培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA培養基）。 2）無菌水、培養皿、接種環、移液管、振蕩器、微波爐、載玻片、超凈工作舍、恒溫培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、試管架、玻璃涂棒、打孔器等。 3）土樣。 4）供試病原菌：稻瘟病菌（Pyricularia grisea），或其他農作物病原真菌。 四、實驗步驟 1.采集土樣 挑選正常生長水稻的田地進行土樣采集。鏟去表層土，用取樣器取規定深度（5～20cm）的土樣，裝入無菌封口塑料袋中，再裝入防水紙袋中，注明采集時間、地點、周邊植被及土質特點等，帶回實驗室陰干后立即分離。 2.制備土壤稀釋液 稱取10g研磨好的土樣至250m1三角燒瓶中，加入90m1無菌水和適量玻璃珠，振蕩15min，充分混勻。于超凈工作臺內用無菌移液管取lm1上述土壤懸浮液，加入盛有9ml無菌水的試管中充分混勻，制備成10-2稀釋度的土壤溶液。然后采用同樣操作方式，從上述試管中取1ml加至另一個盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，制備成10-3稀釋度的土壤溶液。以此類推制備10-4、10-5、10-6不同稀釋倍數的土壤懸浮液備用，如圖1-1所示。 圖1-1 稀釋涂布分離微生物操作流程 3.涂布 將事先配置并經滅菌處理的高氏1號培養基加熱溶化，于超凈工作臺內倒平板。 倒平板的方法：右手持盛有培養基的試管或三角瓶置酒精燈火焰上方5～10cm處，用左手將棉塞輕輕地拔出，試管或瓶口保持對著火焰。左手拿培養皿，利用拇指和中指將皿蓋在火焰上方5～10cm處打開一縫，迅速倒入培養基約15時，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部。然后平置于超凈工作臺內，待冷凝后即為平板。 用無菌移液管分別由10-4、10-5、10-6三管土壤稀釋液中各取0.1ml加入平板中，右手拿無菌玻璃涂棒，將稀釋液沿一條直線輕輕地來回推動，使之分布均勻。加蓋后將培養皿沿一個方向旋轉一定角度，重復涂布動作。如此反復幾次。平板內邊緣處可改變方向用玻璃涂棒再涂布幾次。均勻涂布后，需靜置30min，使菌液吸附進培養基。在每個平板底部用記號筆做好標記以便區分。 4.放線菌分離 將高氏1號培養基平板倒置于28'C恒溫培養箱中培養3～5d。根據放線菌菌落形態差異，將培養后長出的單個放線菌菌落分別挑取少許細胞接種到高氏1號培養基的斜面上，并進行編號。待斜面上長出菌苔后，鏡檢確定是否為單一微生物。若發現有雜菌，需采用平板劃線法進行菌株純化分離，直到獲得純培養。如果平板中真菌或細菌的菌落過多，相互交聯，嚴重影響放線菌單菌落挑選的話，可在培養基中添加適量KZCrZ07（20～150μg/ml）抑制真菌及細菌的生長。 平板劃線方法：在近火焰處，左手拿培養皿，右手拿接種環，挑取待純化的單菌落一環，先在平板培養基的一邊做**次平行劃線3～4條，再轉動培養皿約70°角，并將接種環于火焰上灼燒滅菌，待冷卻后通過**次劃線部分做第二次平行劃線，如此重復2～3次，如圖1-2所示。將樣品在平板上進行稀釋，蓋上培養皿蓋，倒置培養。挑取單個菌落進行純種鑒定。 圖1-2 平板劃線分離微生物操作流程 5.真菌指示菌平板的制備 將實驗室保存的稻瘟病菌接種至PDA培養基平板上，倒置于30℃恒溫培養箱中培養3～5d。然后，在超凈工作臺內用接種環挑取適量真菌菌絲至裝有5ml無菌水的試管中，充分混勻。將該菌懸液適當稀釋，吸取適量菌懸液涂布PDA培養基平板，靜置備用。具體添加量以PDA培養基平板上剛能均勻長滿菌絲為宜。 6.瓊脂塊法篩選目標菌株 將經分離純化獲得的多株放線菌分別用接種環挑取適量細胞至盛有5ml無菌水的試管中，充分混勻，吸取適量菌液涂布高氏1號培養基平板，倒置于28℃恒溫培養箱中培養3～5d。用滅過菌的打孔器，從培養好的放線菌平板上挖取相同大小的放線菌菌塊放到剛制備好的真菌指示菌平板上，以未接菌的高氏1號培養基塊作陰性對照，設3個平行。正置于30℃恒溫培養箱中培養3d。采用十字測量法測抑菌圈直徑，篩選抗真菌的放線菌，如圖1-3所示。 圖1-3 稻瘟病菌為指示菌，瓊脂塊法篩選抑制稻瘟病菌的放線菌（唐顏蘋，2010） 五、實驗結果 將分離的放線菌菌落特征和抑菌圈直徑填入表1-1。 表1-1 分離放線菌的記錄表 六、思考題 1.從土壤中篩選放線菌的過程中，如何簡便地挑選放線菌？ 2.瓊脂塊法篩選抗具菌放線菌的關鍵是什么？能否依據抑菌圈直徑的大小直接判斷生物活性物質的產量？為什么？ 七、參考文獻
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