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海洋低溫酶的發現與發掘 版權信息
- ISBN：9787030752338
- 條形碼：9787030752338 ; 978-7-03-075233-8
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
海洋低溫酶的發現與發掘 內容簡介
海洋低溫酶制劑具有某些特殊的生理生化特征，在食品加工與保鮮、飼料、醫學診斷和環境污染等方面具有非常良好的開發前景。開發利用海洋微生物及海洋低溫酶制劑資源，為解決人類面臨的資源緊缺、環境污染、糧食危機等奠定科學基礎，在世界經濟及社會發展中將產生重大的影響。本書為響應國家"十三五"基礎研究專項規劃，立足低溫酶資源的開發，以纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶、植酸酶等海洋來源的低溫酶制劑的篩選、鑒定、發酵工藝優化、酶學性質等研究為主線，歸納整理了本實驗室針對海洋低溫酶的研究進展及所取得成果，以拓寬產海洋低溫酶菌株的選育、低溫酶制劑的酶學理論研究與市場，助力低溫酶基礎研究及應用。
海洋低溫酶的發現與發掘 目錄
目錄
前言
**章 低溫纖維素酶 1
**節 概述 1
一、來源及分布 2
二、國內外研究概況 3
第二節 菌株選育 11
一、酶活性測定 11
二、篩選 12
三、霉菌B誘變 12
四、菌株SWD-28鑒定 15
第三節 菌株BD22酶學性質研究 16
一、發酵培養基優化 16
二、發酵條件優化 20
三、分離純化 24
第四節 菌株SWD-28酶學性質研究 27
一、發酵培養基優化 27
二、發酵條件優化 35
三、分離純化 42
四、酶學性質表征 43
第五節 總結與討論 46
一、菌株BD22總結 46
二、菌株SWD-28總結 46
參考文獻 47
第二章 低溫脂肪酶 50
**節 概述 50
一、來源及分布 51
二、低溫脂肪酶的理化特征 51
三、脂肪酶的催化機制 52
四、現階段研究熱點及方法 54
五、低溫脂肪酶的應用及市場前景 54
第二節 菌株選育 57
一、酶活性測定 57
二、篩選 59
三、誘變 60
四、鑒定 62
第三節 菌株FS119-1酶學性質研究 68
一、發酵培養基優化 68
二、發酵條件優化 78
三、分離純化 85
四、酶學性質表征 86
第四節 總結與討論 88
參考文獻 89
第三章 低溫淀粉酶 90
**節 概述 90
一、來源及分布 91
二、國內外研究概況 93
三、應用 95
第二節 菌株選育 96
一、酶活性測定 96
二、篩選 97
三、鑒定 99
第三節 菌株SX001酶學性質研究 102
一、酶活性及生長曲線測定 102
二、發酵培養基優化 102
三、發酵條件優化 107
四、發酵條件響應面研究 111
五、分離純化 115
六、酶學性質表征 115
第四節 總結與討論 118
參考文獻 119
第四章 低溫生淀粉糖化酶 121
**節 概述 121
一、生淀粉酶 121
二、生淀粉糖化酶 122
三、低溫生淀粉糖化酶 125
四、生淀粉糖化酶產生菌的篩選 125
第二節 菌株選育 127
一、酶活性測定 127
二、篩選 128
三、鑒定 129
第三節 菌株RS01酶學性質研究 132
一、發酵培養基優化 133
二、發酵條件優化 138
三、分離純化 141
四、酶學性質表征 141
第四節 總結與討論 144
參考文獻 145
第五章 低溫木聚糖酶 147
**節 概述 147
一、纖維素、木聚糖概述 147
二、木聚糖酶的應用 151
三、來源及分布 154
四、研究現狀 154
第二節 菌株選育 157
一、酶活性測定 157
二、篩選 158
三、鑒定 159
第三節 菌株MS001酶學性質研究 162
一、發酵培養基優化 163
二、發酵條件優化 168
三、分離純化 172
四、酶學性質表征 174
第四節 總結與討論 176
參考文獻 177
第六章 低溫葡萄糖氧化酶 181
**節 概述 181
一、來源及分布 181
二、國內外研究概況 183
第二節 菌株選育 187
一、酶活性測定 188
二、篩選 188
三、鑒定 189
第三節 菌株GOD2酶學性質研究 192
一、發酵培養基優化 192
二、發酵條件優化 196
三、分離純化 202
四、酶學性質表征 204
第四節 總結與討論 206
參考文獻 206
第七章 低溫植酸酶 208
**節 概述 208
一、來源及分布 209
二、國內外研究概況 210
第二節 菌株選育 218
一、酶活性測定 218
二、篩選 220
三、鑒定 220
第三節 菌株CZC0806酶學性質研究 224
一、發酵培養基優化 225
二、發酵條件優化 230
三、酶學性質表征 234
第四節 菌株Y1酶學性質研究 236
一、發酵培養基優化 236
二、發酵條件優化 241
三、酶學性質表征 245
第五節 總結與討論 248
參考文獻 248
第八章 低溫纖溶酶 251
**節 概述 251
一、來源及分布 251
二、國內外研究概況 252
第二節 菌株選育 258
一、篩選 259
二、鑒定 259
第三節 菌株CNY16酶學性質研究 262
一、發酵培養基優化 263
二、發酵條件優化 266
三、發酵綜合設計 268
四、分離純化 273
五、酶學性質表征 275
第四節 總結與討論 277
參考文獻 278
第九章 低溫超氧化物歧化酶 280
**節 概述 280
一、來源及分布 280
二、國內外研究概況 281
三、SOD的應用 282
第二節 菌株選育 284
一、酶活性測定 284
二、篩選 286
三、鑒定 286
第三節 菌株CD-008酶學性質研究 289
一、發酵培養基優化 289
二、發酵條件優化 298
三、酶學性質表征 304
第四節 總結與討論 307
參考文獻 308
前言
**章 低溫纖維素酶 1
**節 概述 1
一、來源及分布 2
二、國內外研究概況 3
第二節 菌株選育 11
一、酶活性測定 11
二、篩選 12
三、霉菌B誘變 12
四、菌株SWD-28鑒定 15
第三節 菌株BD22酶學性質研究 16
一、發酵培養基優化 16
二、發酵條件優化 20
三、分離純化 24
第四節 菌株SWD-28酶學性質研究 27
一、發酵培養基優化 27
二、發酵條件優化 35
三、分離純化 42
四、酶學性質表征 43
第五節 總結與討論 46
一、菌株BD22總結 46
二、菌株SWD-28總結 46
參考文獻 47
第二章 低溫脂肪酶 50
**節 概述 50
一、來源及分布 51
二、低溫脂肪酶的理化特征 51
三、脂肪酶的催化機制 52
四、現階段研究熱點及方法 54
五、低溫脂肪酶的應用及市場前景 54
第二節 菌株選育 57
一、酶活性測定 57
二、篩選 59
三、誘變 60
四、鑒定 62
第三節 菌株FS119-1酶學性質研究 68
一、發酵培養基優化 68
二、發酵條件優化 78
三、分離純化 85
四、酶學性質表征 86
第四節 總結與討論 88
參考文獻 89
第三章 低溫淀粉酶 90
**節 概述 90
一、來源及分布 91
二、國內外研究概況 93
三、應用 95
第二節 菌株選育 96
一、酶活性測定 96
二、篩選 97
三、鑒定 99
第三節 菌株SX001酶學性質研究 102
一、酶活性及生長曲線測定 102
二、發酵培養基優化 102
三、發酵條件優化 107
四、發酵條件響應面研究 111
五、分離純化 115
六、酶學性質表征 115
第四節 總結與討論 118
參考文獻 119
第四章 低溫生淀粉糖化酶 121
**節 概述 121
一、生淀粉酶 121
二、生淀粉糖化酶 122
三、低溫生淀粉糖化酶 125
四、生淀粉糖化酶產生菌的篩選 125
第二節 菌株選育 127
一、酶活性測定 127
二、篩選 128
三、鑒定 129
第三節 菌株RS01酶學性質研究 132
一、發酵培養基優化 133
二、發酵條件優化 138
三、分離純化 141
四、酶學性質表征 141
第四節 總結與討論 144
參考文獻 145
第五章 低溫木聚糖酶 147
**節 概述 147
一、纖維素、木聚糖概述 147
二、木聚糖酶的應用 151
三、來源及分布 154
四、研究現狀 154
第二節 菌株選育 157
一、酶活性測定 157
二、篩選 158
三、鑒定 159
第三節 菌株MS001酶學性質研究 162
一、發酵培養基優化 163
二、發酵條件優化 168
三、分離純化 172
四、酶學性質表征 174
第四節 總結與討論 176
參考文獻 177
第六章 低溫葡萄糖氧化酶 181
**節 概述 181
一、來源及分布 181
二、國內外研究概況 183
第二節 菌株選育 187
一、酶活性測定 188
二、篩選 188
三、鑒定 189
第三節 菌株GOD2酶學性質研究 192
一、發酵培養基優化 192
二、發酵條件優化 196
三、分離純化 202
四、酶學性質表征 204
第四節 總結與討論 206
參考文獻 206
第七章 低溫植酸酶 208
**節 概述 208
一、來源及分布 209
二、國內外研究概況 210
第二節 菌株選育 218
一、酶活性測定 218
二、篩選 220
三、鑒定 220
第三節 菌株CZC0806酶學性質研究 224
一、發酵培養基優化 225
二、發酵條件優化 230
三、酶學性質表征 234
第四節 菌株Y1酶學性質研究 236
一、發酵培養基優化 236
二、發酵條件優化 241
三、酶學性質表征 245
第五節 總結與討論 248
參考文獻 248
第八章 低溫纖溶酶 251
**節 概述 251
一、來源及分布 251
二、國內外研究概況 252
第二節 菌株選育 258
一、篩選 259
二、鑒定 259
第三節 菌株CNY16酶學性質研究 262
一、發酵培養基優化 263
二、發酵條件優化 266
三、發酵綜合設計 268
四、分離純化 273
五、酶學性質表征 275
第四節 總結與討論 277
參考文獻 278
第九章 低溫超氧化物歧化酶 280
**節 概述 280
一、來源及分布 280
二、國內外研究概況 281
三、SOD的應用 282
第二節 菌株選育 284
一、酶活性測定 284
二、篩選 286
三、鑒定 286
第三節 菌株CD-008酶學性質研究 289
一、發酵培養基優化 289
二、發酵條件優化 298
三、酶學性質表征 304
第四節 總結與討論 307
參考文獻 308
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海洋低溫酶的發現與發掘 節選
**章低溫纖維素酶 **節概述 石油等不可再生能源的枯竭，使得可再生生物質能源的開發異常緊迫。我國作為農業大國，每年都會囤積大量農作物秸稈。截至2009年，我國農作物秸稈可收集資源量達到6.87x10st，理論資源量達到8.20x10st，占世界秸稈總量的20%～30%。目前，我國秸稈主要用于還田、制備粗飼料和肥料，以及生產食用菌，但農作物秸稈在短時間內很難被分解利用，導致其實際用量不超過總量的40%，大量被閑置或焚燒，帶來了嚴重的資源浪費和環境污染。 農作物秸稈之所以難以被分解，緣于高等植物細胞壁中含有大量的纖維素、半纖維素、木質素，這些結構通過非共價鍵及共價鍵緊密連接，形成木質纖維素這種復合物，占植物干重的70%～75%。一般來說，水稻等農作物秸稈中的纖維素含量為30%～35%，半纖維素含量為25%～30%，木質素含量為20%～25%。棉花中的纖維素含量將近100%，為純天然的纖維素來源。纖維素功能眾多，可用于制造人造棉和人造絲、炸藥、膠卷、塑料、牲畜飼料，以及生產乙醇。但纖維素難以被降解，若能被酶高效附著并酶解，則會產生大量能量，以供生產利用。而在這些組分中，纖維素占比較半纖維素和木質素有明顯優勢，有很大的利用空間。 纖維素在環境中比較穩定，是地球上分布*廣、*為廉價的可再生資源，可用于生產生物質能源。它是葡萄糖以β-1，4糖苷鍵結合形成的直鏈高分子化合物，經驗式為，其中n是糖苷鍵數目，稱為聚合度（DP），纖維素的聚合范圍寬，可以從幾百到15000左右，甚至更大。纖維素密度大、結構復雜，特別是結晶纖維素，若不使用化學或機械等方法預處理，則難以被水解。纖維素主要由排列整齊而規則的結晶區（crystalline）和相對不規則、松散的非結晶區（amorphism）兩部分組成，結晶度一般在30%～80%，結晶區分子鏈內、鏈間及分子鏈與表面分子之間形成的氫鍵，使纖維素分子結構穩定難以被降解，非結晶區纖維素結構比較疏松，容易被分解利用。 自1906年在蝸牛消化液中被發現起纖維素酶就受到世界各國的重視。20世紀60年代，研究人員發現，利用微生物所產纖維素酶分解纖維素是一種相對高效且無污染的方法。纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶的總稱，是復合誘導酶，它們協同作用，分解纖維素產生寡糖和纖維二糖，*終水解為葡萄糖。纖維素酶系主要包括內切葡聚糖酶[簡稱C1或EG，如內切1，4-p-D-葡聚糖酶（EC3.2.1.4）]、纖維二糖水解酶（外切葡聚糖酶）[簡稱CX或CBH，如外切1，4-p-D-葡聚糖酶（EC3.2.1.91）和p-1，4-葡糖苷酶（簡稱BG，EC3.2.1.21）3種水解酶，在不同微生物合成的纖維素酶系中，3種酶所占比例不同。自然界中產纖維素酶微生物以真菌居多，細菌較少。前者所產纖維素酶活性高，但*適作用溫度普遍較高，后者中有更多菌種能夠產生耐低溫性能較好的酶，但產纖維素酶活性較低。 目前的諸多工業生產及應對環境污染問題都有纖維素酶的參與。而低溫纖維素酶因其反應所需能量低，更是被認為應用前景不可估量。 一、來源及分布 纖維素酶的來源十分廣泛，自然界中的部分細菌、真菌、動物和植物等都具有合成纖維素酶的能力。國外于20世紀40～50年代就對產纖維素酶的微生物進行了大量的分離篩選工作，建立了較為完整的分離篩選方法。我國對纖維素酶的研究開始于20世紀60年代，選育出了一批纖維素酶菌種。目前，用于生產纖維素酶的微生物大多屬于真菌，研究得較多的有木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（.Penicinium）。產生纖維素酶的細菌主要有梭菌屬（Clostridium）、纖維單胞菌屬（GMuhmomas）、芽抱桿菌屬（Bacillus）、高溫單抱菌屬（Thermomonospora）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、擬桿菌屬（Bocteroz'des）、歐文氏菌屬（Erwinia）、小雙抱菌屬（Micro況spora）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等。其中纖維單胞菌（Gcllulomotnas fimi）和高溫單抱菌（Thermomonospora fusca）是被廣泛研究的兩種產生纖維素酶的細菌。 纖維素酶的分子特征和催化活性隨來源而變化。近來，隨著可持續、節能理念的提出，低溫纖維素酶的研究逐漸增多，與同類型常溫酶（*適作用溫度多為45～65°C）相比，低溫纖維素酶普遍存在*適作用溫度低、低溫（S40C）催化效率高、熱穩定性差等特性，生產上只需較低溫度的熱處理即可使酶失活，既縮短了處理時間又節省了成本，更適合工業應用，部分低溫纖維素酶的來源及性質如表1-1所示。 國外于1999年即發現低溫纖維素酶，國內低溫纖維素酶研究較晚。呂明生等（2007）從連云港高公島海域的樣品中篩選得到一株產低溫纖維素酶的菌株。對該菌生物學特性進行研究發現，其為革蘭氏陰性桿菌，有莢膜，無芽孢，生長溫度為4～35°C，*適生長溫度為25C，*適生長pH為8.0，*適NaCl濃度為3%，所產低溫纖維素酶的*適作用溫度為30C，該酶在10C仍具有較高活性，很有潛在的工業應用價值。*終鑒定菌株Z6為食鹿角菜交替假單胞菌carrageenovora）。 王玢等（2003）從黃海的深海海底泥樣中篩選出一株產低溫纖維素酶的海洋細菌，鑒定為革蘭氏陰性桿菌。該菌既能產生羥甲基纖維素酶（CMCase），又能降解微晶纖維素，且有淀粉酶活性。研究人員對該菌生長特征及所產低溫纖維素酶的性質進行了初步研究。該菌*適生長溫度為20C，*高生長溫度為40C，在0C也能生長，是典型的嗜冷菌。該菌所產低溫纖維素酶*適作用溫度為35C，在10C仍有較高活性，*適作用pH為6.0，屬酸性酶。2003年，有人從15C的牲畜糞肥沼氣池中分離到一種芽孢梭菌屬細菌PXYL1，該菌生長溫度為5～50C，*適生長溫度為20C，被認為是耐冷菌。該菌分泌包括內切葡聚糖酶和濾紙纖維素酶在內的多種胞外水解酶，且這些酶*適作用溫度均為20C。 曾胤新等（2005）從北極楚科奇海海水中分離出一株產低溫纖維素酶的耐冷交替假單胞菌BSw20308，該菌*適生長溫度為10C，35C不生長；pH7.0～8.0、含2.0%～3.0%NaCl的培養基*適宜菌株生長與產酶；可溶性淀粉、酵母浸出液分別是有利于菌株生長及產酶的碳源、氮源物質；蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖及麩皮對羥甲基纖維素酶（CMCase）的合成具有明顯誘導作用；羥甲基纖維素鈉（CMC-Na）、麩皮、可溶性淀粉及麥芽糖對濾紙纖維素酶的合成有一定誘導作用，單糖與部分雙糖（蔗糖、纖維二糖及乳糖）則起阻遏作用；在指數生長后期至穩定早期，大量產CMCase;發酵液含CMCase、濾紙纖維素酶及葡糖苷酶，以CMCase活力*高；胞外CMCase活力占總CMCase活力的74.1%左右；酶*適作用溫度為35°C，5C時酶活性保留50%左右；酶對熱敏感，35C半衰期為3h，25°C下酶活性穩定；酶*適作用pH為8.0。 劉秀華等（2012）從采集的腐殖質土樣中發現一株纖維弧菌，其具有瓊脂液化和降解能力，所產低溫纖維素酶*適作用溫度為40°C，在0°C時的殘留酶活性為*高酶活性的60%。 海洋是地球上*大的低溫區域，從其中篩選低溫酶為菌種開發新途徑。在該生態系統中，產低溫纖維素酶的低溫菌幾乎都屬于交替假單胞菌屬，而從其他環境中篩選出的菌屬則有所不同。 二、國內外研究概況 國內外關于產低溫纖維素酶菌株的研究主要集中在菌株的分離篩選、鑒定、培養條件的優化、生長特性、產酶條件優化、酶學性質研究及酶基因的克隆和表達方面。 （一）發展歷程 自1906年纖維素酶在蝸牛消化液中被發現，其研究經歷了三個階段。 **階段：從1906年發現纖維素酶到1980年，主要研究纖維素酶的分離純化。 第二階段：1981～1988年，主要研究纖維素酶的基因克隆及一級結構預測。 第三階段：1989年至今，主要研究纖維素酶的結構和功能。 早在1906年，Seilliere就在蝸牛的消化液中發現了纖維素酶。20世紀70年代，一些學者提出需要多種纖維素酶協同作用，才能表現出很強的纖維素分解能力，之后有研究分離到協同作用的3種纖維素酶。2007年，美國能源部聯合基因組研究所（Joint Genome Institute）與諾維信（Novozymes）公司美國研究部等多家機構首次發表了里氏木霉野生菌株QM6a的全基因組測序結果。2009年以來，中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態研究所與山東大學合作，開展了一株產纖維素酶青霉及其突變株的比較基因組研究，找到并驗證了高產纖維素酶突變株的大量突變位點，包括纖維素酶編碼基因啟動子、蛋白酶表達調控因子和淀粉酶表達調控因子上的突變，并驗證了存在多個增強子結合位點。 目前，主要是利用結構生物學及蛋白質工程的方法對纖維素酶分子的結構和功能進行研究，包括纖維素酶結構域的拆分、解析，功能性氨基酸的確定，水解雙置換機制的確立，分子折疊和催化機制關系的探討，以及關于纖維素酶檢測方法的研究（Johnsenand Krause，2014）。 我國在20世紀就已經開始規；a纖維素酶。20世紀90年代初，黑龍江省海林市萬力達集團公司首條年產2000t纖維素酶生產線正式投產，我國成為繼美國、日本、丹麥之后世界上第四個能生產纖維素酶的國家。我國對纖維素酶的需求量很大，年需求量在3000～4000t，雖然90年代后建成了一些纖維素酶生產廠，但目前國內主要研究集中在纖維素酶的特性、作用機制、培養條件、應用試驗等方面，至今大多仍未能規模化生產，滿足不了市場的需要。 （二）纖維素酶的理化性質 纖維素酶作為復合酶，在不同微生物中的分泌比例存在差異，即使同一菌株，在不同的底物、不同的培養基、不同的溫度、不同的pH等生長條件下，所分泌的三種組分比例也不相同。纖維素酶的理化性質包括分子量、等電點、*適作用條件等，不同纖維素酶的分子量差異很大，等電點等也不盡相同，因此*適作用條件也存在差異。 結構決定性質，纖維素酶分子大小范圍很廣。一般內切酶分子質量為23～146kDa，外切酶為38～118kDa，p-葡糖苷酶為90～100kDa（胞內酶）和47～76kDa（胞外酶）。但也有一些酶的分子量比較特殊，如纖維黏菌的內切酶僅為6.3kDa，而蠶豆腐皮鐮孢霉的p-葡糖苷酶的分子質量卻高達400kDa。纖維素酶的等電點也存在較大差別。真菌纖維素酶的等電點一般在7以下，細菌纖維素酶的等電點一般大于7或在7左右。培養條件也會對酶的等電點產生影響，例如，棘胞曲霉產的纖維素酶，在液體培養時各組分的等電點為酸性；但在固體培養基中，酶組分的等電點為3.5～10.0，幾乎散布在等電聚焦的兩性電解質載體上。大部分真菌產的纖維素酶一般偏酸性，大多數纖維素酶組分的*適作用pH在5左右，但也存在一些耐堿或嗜堿纖維素酶被用于洗滌行業。 大部分纖維素酶的*適作用溫度為45～65°C，低溫纖維素酶*適作用溫度可低至20°C。高活性低溫酶的市場占比低，因此篩選高活性低溫纖維素酶意義重大。 木霉和青霉可大量分泌胞外纖維素酶，但該酶對天然纖維素的降解能力弱；擔子菌也可分泌胞外纖維素酶，該酶活性低但降解能力強；細菌所產纖維素酶位于細胞壁，分解天然纖維素能力強。 通過序列比對對纖維素酶的一級結構進行分析，可觀察序列的同源性，因為同一家族的纖維素酶往往具有高度保守的氨基酸序列，所以同源性較高，易于判斷和發現酶的種類與功能。現階段的酶工程學將來自不同物種的作用于不同碳水化合物的酶根據碳水化合物活性酶數據庫（CAZy）分成不同的酶家族，將氨基酸序列相似度超過30%的歸為同一家族，F已經發現的131個家族中，纖維素酶
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