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醫學生物技術實驗 版權信息
- ISBN：9787030743992
- 條形碼：9787030743992 ; 978-7-03-074399-2
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>>
醫學生物技術實驗 內容簡介
本教材著重突出“基礎理論、基本技能、基本技術”和“實驗室安全培訓”、“學生創新能力”的培養。在此基礎上，針對生物技術專業教學改革的特點，主要進行了“以創新為方法、以培養高質量本科人才為目的”的實踐技能教學改革。本教材匯集優秀一線師資力量，融合生物化學、分子生物學、蛋白質工程、抗體工程的理論和一線的實驗室技術的優勢，較全面地介紹了各種技能的原理，更重要的是，一線的實驗教學內容可使學生通過本教材真切地、有效地將實驗完成，為學生掌握基礎研究夯實基礎。
醫學生物技術實驗 目錄
目錄
**篇 緒論
**章 常用儀器設備及基本實驗技術 1
**節 顯微鏡的結構和使用方法 1
第二節 離心機的基本原理與使用方法 7
第三節 分光光度計與酶標儀的原理與使用方法 10
第四節 核酸電泳與蛋白電泳的原理與使用方法 15
第五節 聚合酶鏈反應儀與熒光定量聚合酶鏈反應儀的原理與使用方法 26
第二章 生物學實驗室安全與管理 32
**節 實驗室安全概述 32
第二節 高壓滅菌器使用的注意事項 33
第三節 實驗室生物安全防護 35
第四節 危險化學品使用的注意事項 36
第五節 培養箱使用的注意事項 37
第六節 實驗動物的安全管理和注意事項 38
第二篇 基 礎 實 驗
第三章 生物化學與分子生物學實驗 40
實驗一 β-半乳糖苷酶活性的測定方法 40
實驗二 BCA法和紫外分光光度法測定蛋白質濃度 42
實驗三 聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測工程菌中綠色熒光蛋白的表達 44
實驗四 蛋白質印跡分析 47
實驗五 RNA的提取與電泳鑒定 52
實驗六 反轉錄PCR 54
實驗七 腎上腺素、胰島素對兔血糖濃度的影響 57
實驗八 質粒DNA的提取與鑒定 59
第四章 生物技術實驗 62
實驗九 培養基的配制與滅菌技術 62
實驗十 微生物的培養與保種技術 63
實驗十一 噬菌體的分離及效價測定 69
實驗十二 真核細胞轉染 71
實驗十三 單核苷酸多態性實驗 74
實驗十四 染色質免疫共沉淀技術 75
實驗十五 發酵法制備發酵乳 78
實驗十六 細胞培養技術 79
實驗十七 細胞的凍存和復蘇 84
實驗十八 細胞計數和細胞活力檢測 85
實驗十九 CCK-8法檢測細胞活性 87
實驗二十 細胞凋亡的形態學觀察 89
實驗二十一 流式細胞儀檢測細胞凋亡——Annexin V/PI雙染色法 91
實驗二十二 ELISA法檢測腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）的含量 92
實驗二十三 雙轉染報告系統的檢測 94
實驗二十四 彗星實驗檢測細胞DNA的損傷 96
實驗二十五 離子交換柱層析法分離氨基酸 98
實驗二十六 免疫熒光染色 100
實驗二十七 免疫組織化學染色 101
實驗二十八 固定化酵母細胞蔗糖酶活性測定 103
實驗二十九 免疫共沉淀技術 104
第三篇 創新實驗
第五章 干細胞生物學概論 107
實驗三十 小鼠胚胎干細胞的體外培養 107
實驗三十一 人類胚胎干細胞的衍化生成 110
實驗三十二 健康人體尿液中提取細胞分離、培養實驗 112
實驗三十三 誘導多能干細胞實驗——小鼠iPS細胞系的建立 113
實驗三十四 堿性磷酸酶染色法檢測 iPS 細胞多能性 116
第六章 發育生物學實驗 118
實驗三十五 斑馬魚胚胎紅細胞活體染色 118
實驗三十六 斑馬魚軟骨染色觀察 119
實驗三十七 斑馬魚囊胚中期轉換前后胰島素蛋白的表達差異 120
第七章 實驗動物學 122
實驗三十八 小鼠學習及記憶檢測的行為學實驗：水迷宮 122
實驗三十九 小鼠高架十字迷宮行為學檢測 125
實驗四十 小鼠強迫游泳行為學測試 126
實驗四十一 小鼠懸尾行為學測試 128
實驗四十二 小鼠糖水偏好行為學測試 129
實驗四十三 利用光遺傳學技術調控小鼠搔癢行為實驗 131
實驗四十四 小鼠腦部的立體定向手術及藥物微量注射 133
參考文獻 138
**篇 緒論
**章 常用儀器設備及基本實驗技術 1
**節 顯微鏡的結構和使用方法 1
第二節 離心機的基本原理與使用方法 7
第三節 分光光度計與酶標儀的原理與使用方法 10
第四節 核酸電泳與蛋白電泳的原理與使用方法 15
第五節 聚合酶鏈反應儀與熒光定量聚合酶鏈反應儀的原理與使用方法 26
第二章 生物學實驗室安全與管理 32
**節 實驗室安全概述 32
第二節 高壓滅菌器使用的注意事項 33
第三節 實驗室生物安全防護 35
第四節 危險化學品使用的注意事項 36
第五節 培養箱使用的注意事項 37
第六節 實驗動物的安全管理和注意事項 38
第二篇 基 礎 實 驗
第三章 生物化學與分子生物學實驗 40
實驗一 β-半乳糖苷酶活性的測定方法 40
實驗二 BCA法和紫外分光光度法測定蛋白質濃度 42
實驗三 聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測工程菌中綠色熒光蛋白的表達 44
實驗四 蛋白質印跡分析 47
實驗五 RNA的提取與電泳鑒定 52
實驗六 反轉錄PCR 54
實驗七 腎上腺素、胰島素對兔血糖濃度的影響 57
實驗八 質粒DNA的提取與鑒定 59
第四章 生物技術實驗 62
實驗九 培養基的配制與滅菌技術 62
實驗十 微生物的培養與保種技術 63
實驗十一 噬菌體的分離及效價測定 69
實驗十二 真核細胞轉染 71
實驗十三 單核苷酸多態性實驗 74
實驗十四 染色質免疫共沉淀技術 75
實驗十五 發酵法制備發酵乳 78
實驗十六 細胞培養技術 79
實驗十七 細胞的凍存和復蘇 84
實驗十八 細胞計數和細胞活力檢測 85
實驗十九 CCK-8法檢測細胞活性 87
實驗二十 細胞凋亡的形態學觀察 89
實驗二十一 流式細胞儀檢測細胞凋亡——Annexin V/PI雙染色法 91
實驗二十二 ELISA法檢測腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）的含量 92
實驗二十三 雙轉染報告系統的檢測 94
實驗二十四 彗星實驗檢測細胞DNA的損傷 96
實驗二十五 離子交換柱層析法分離氨基酸 98
實驗二十六 免疫熒光染色 100
實驗二十七 免疫組織化學染色 101
實驗二十八 固定化酵母細胞蔗糖酶活性測定 103
實驗二十九 免疫共沉淀技術 104
第三篇 創新實驗
第五章 干細胞生物學概論 107
實驗三十 小鼠胚胎干細胞的體外培養 107
實驗三十一 人類胚胎干細胞的衍化生成 110
實驗三十二 健康人體尿液中提取細胞分離、培養實驗 112
實驗三十三 誘導多能干細胞實驗——小鼠iPS細胞系的建立 113
實驗三十四 堿性磷酸酶染色法檢測 iPS 細胞多能性 116
第六章 發育生物學實驗 118
實驗三十五 斑馬魚胚胎紅細胞活體染色 118
實驗三十六 斑馬魚軟骨染色觀察 119
實驗三十七 斑馬魚囊胚中期轉換前后胰島素蛋白的表達差異 120
第七章 實驗動物學 122
實驗三十八 小鼠學習及記憶檢測的行為學實驗：水迷宮 122
實驗三十九 小鼠高架十字迷宮行為學檢測 125
實驗四十 小鼠強迫游泳行為學測試 126
實驗四十一 小鼠懸尾行為學測試 128
實驗四十二 小鼠糖水偏好行為學測試 129
實驗四十三 利用光遺傳學技術調控小鼠搔癢行為實驗 131
實驗四十四 小鼠腦部的立體定向手術及藥物微量注射 133
參考文獻 138
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醫學生物技術實驗 節選
**篇緒論 **章常用儀器設備及基本實驗技術 **節顯微鏡的結構和使用方法 一、普通光學顯微鏡 （―）實驗目的 1.了解普通光學顯微鏡的基本結構和工作原理。 2.掌握低倍鏡和高倍鏡的正確使用方法。 3.了解普通光學顯微鏡維護的注意事項。 （二）實驗物品 普通光學顯微鏡，標本，擦鏡紙，擦鏡液，香柏油等。 （三）實驗原理 普通光學顯微鏡包括正置和倒置光學顯微鏡，二者的結構類似，其不同在于物鏡與照明系統是否顛倒，下面以正置光學顯微鏡為例說明。 顯微鏡包括機械和光學兩個部分（圖1-1-1）。 1.機械部分 （1）鏡座：是顯微鏡的底座，常為一馬蹄形鐵座，用以支持和穩定顯微鏡。 （2）鏡臂（執手）：是移動顯微鏡時的執手處，呈弓形，與鏡柱相連處有一傾斜關節，可使顯微鏡向后傾斜至90°以內的任何角度，但一般不宜超過40° ，以免顯微鏡傾倒（注意：觀察能流動的液體材料時則不宜傾斜）。 （3）鏡柱：連接鏡座和鏡臂的直立短柱，對鏡臂起支撐作用。 （4）大螺旋（粗調節器）：轉動時，可使鏡筒作較大距離升降，能調節物鏡與標本間的距離， 得到清晰的物像（注意：轉動螺旋時，不能太快太急，必須慢慢地旋轉）。 （5）小螺旋（細調節器）：轉動時，可使鏡筒緩慢地上下升降，能更精細地調節物鏡與標本間的距離，顯示更清晰的物像。 （6）標本移動器：位于載物臺側面，通過旋轉標本移動器可使標本進行左右、前后方向的移動。 （7）旋轉盤：呈圓盤形，一般具有螺紋形圓孔2～4個，用于放置幾個不同放大倍數的物鏡，旋轉盤可旋轉，可隨意調換各個不同倍數的物鏡（注意：轉換 物鏡時必須用手轉動旋轉盤而不能用手拿著物鏡來旋轉，否則鏡頭易松脫，轉動時亦不能過急過快）。 （8）載物臺：為呈圓形或方形的平面臺，中心有通光孔（供光線通過），載物臺上裝有標本移動器，既可固定玻片標本，又可前后左右移動。標本移動器 上有標尺，可利用標尺上的刻度作標記，記認要觀察的標本。 2.光學部分 （1）光源：電光源顯微鏡以可見光為光源，只需通過調節旋鈕，即可連續地增強或降低光線的強度（注意：電光源不能長期處于高亮狀態！在不觀察標本 的時候必須把光源調暗）。 （2）聚光鏡：位于載物臺通光孔的下方，由一片或數片透鏡組成，可把反光鏡反射來的光線聚合成光束，使較強的光線照于標本上，以便于觀察。 （3）虹彩光圈：裝在聚光鏡下方，可調節光線的強弱。虹彩光圈由十幾張金屬薄片組成，外側有一個細柄，推動它可調節光圈開孔的大小，從而調節光線 強弱。 （4）目鏡：呈圓筒形，安裝于鏡筒的上端，由兩個透鏡組成，上面刻有此鏡的放大率如5X、6X、10X等符號，即放大5倍、6倍、10倍等，一般實驗中用10X 的目鏡。 （5）物鏡：呈圓筒形，裝在旋轉盤下，生物學顯微鏡一般有兩種或三種物鏡（圖1-1-2）。 1）低倍鏡：鏡身較短，上刻有5X、10X的符號，即放大5倍、10倍的物鏡。 2）高倍鏡：鏡身較長，上刻有40X、45X、65X的符號，即放大40倍、45倍、65倍的物鏡。 3）油鏡：鏡身較長，上刻有100X的符號，即放大100倍的物鏡。 顯微鏡的放大倍數等于物鏡和目鏡放大倍數的乘積。例如，物鏡為45X，目鏡為10X時，總放大倍數為45X10=450。制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65～ 1.78，所用介質的折射率越接近玻璃越好。普通光線的波長為400～700nm，分辨力數值不會小于0.2pm，人眼的分辨力為0.2mm，因此顯微鏡的*大設計倍數為 1000X。 圖1-1-2顯微鏡物鏡 注意：透鏡不能用手去摸，以免損壞或弄臟鏡頭，只能用擦鏡紙揩拭。 大多數顯微鏡，通常在物鏡上都標有表示主要性能的參數，如10倍物鏡標有10/0.25和160/0.17，此處10為物鏡的放大倍數，0.25為數值孔徑（有的寫成 N.A.0.25），160為鏡筒長度（單位：毫米），0.17為所要求的蓋玻片厚度（單位：毫米）。以上各主要參數的推算，物理意義和顯微鏡的放大原理，將在物理 學的課程中學習。現對使用顯微鏡時要注意**章常用儀器設備及基本實驗技術的相互間有影響的幾個主要性能簡述如下： A.分辨率（鑒別率、分辨力和分辨本領）：分辨率（resolvingpower，R）指能區分開兩個物點間*小距離的能力，顯微鏡的分辨力主要由物鏡的分辨力決 定，它是指可以分辨被檢物體微細結構的能力，也就是分辨兩個物點之間*短距離的能力。因此，分辨力和*小分辨距離是成反比的。R=2NA/A，其中k為入射 光線波長，NA為鏡口率（數值孔徑），計算公式為NA=n sina/2（n為介質折射率；a為鏡口角，樣品對物鏡鏡口的張角）。 B.放大率（放大倍數）顯微鏡適合的放大倍數決定于物鏡的數值孔徑，所以有效的放大率一般應為數值孔徑的500～1000倍。在選擇總放大倍數時，要考慮 物鏡與目鏡的匹配，并不是越大越好。超過了上述限度，物像反而會越來越模糊。 C.清晰度：是指影像上各細部影紋及其邊界的清晰程度。它除了主要與物鏡的性能有關外，亦與其他性能有關。如前述，物鏡與目鏡的組合超出了有效的放 大倍數時亦影響清晰度。 D.焦點深度（場深）在顯微鏡中形成一個清晰物像的物體層厚度稱為焦點深度，也就是說，當焦點與某一物點一致時，這一點和其上下兩側都能看得清楚， 這清晰部位的厚度就是焦點深度。焦點深度與物鏡的數值孔徑或顯微鏡的總放大率成反比，所以在使用高倍鏡時，必須不斷、輕微地反復轉動小螺旋，才能觀察 到被檢物不同深度的各層結構。 E.鏡像亮度：鏡像亮度與數值孔徑的平方成正比，與顯微鏡的總放大率的平方成反比。在其他條件相同時，數值孔徑越大，則鏡像越亮。 鏡像亮度和視野亮度不同，視野亮度不僅與物鏡和目鏡有關，而且還與聚光器、虹彩光圈、反光鏡和光源有關。 （四）實驗步驟 使用顯微鏡時，除注意視野亮度及焦距的調節外，還要注意顯微鏡各主要性能相互間的關系，才能發揮*好的觀察效果。在使用顯微鏡時要按不同檢視法要 求的步驟進行。 1.低倍鏡的檢視法 （1）將顯微鏡正放在離桌邊3～6cm處；鏡臂對向自己的左胸前，便于左眼觀察，右眼畫圖。調節傾斜關節，使載物臺保持適宜的角度，注意傾斜角度不能 過大，否則顯微鏡易失去重心而傾覆。 （2）將大螺旋逆時針方向轉動，降低載物臺，然后轉動旋轉盤，使目鏡與低倍物鏡對準。 （3）將光源打開，從目鏡中觀察，并旋轉旋鈕調節光源使光度合適。 （4）將玻片標本置于載物臺上，把標本所觀察部分移至通光孔中央處。 （5）觀察者一面從旁邊觀察，一面按順時針方向轉動大螺旋，使載物臺徐徐上升，直至物鏡與玻片將要接觸為止（切勿使物鏡與玻片相碰）。 （6）從目鏡向下看，同時將大螺旋徐徐按逆時針方向轉動，使載物臺下降至標本的物像出現為止。 （7）旋動小螺旋，使載物臺稍向上或稍向下移動，至物像清晰為止。 （8）可一面觀察，一面移動玻片，尋找所需要的部分，并把它置于視野中央。 2.高倍鏡的檢視法高倍鏡的放大率較大，適合觀察物體的細微結構，但必須在低倍鏡下找到物像后，才能轉換為高倍鏡，具體步驟： （1）如上法，先用低倍鏡找到標本，并把己調清晰的物像移到視野中央。 （2）直接轉動旋轉盤換上高倍鏡。 （3）—邊觀察，一邊調節小螺旋（注意此時不能用大螺旋調節）直到物像清晰為止，若視野亮度不夠時，可把光線亮度增大（普通光源顯微鏡可調節光源 ，或放大虹彩光圈），使視野的亮度合適。 （4）觀察完畢后，必須先轉回低倍物鏡，再取下標本，以免高倍物鏡頭被碰壞或沾污。 3.油鏡檢視法在低倍鏡下把要觀察的部位移到視野中央，轉動旋轉盤換上高倍鏡，把觀察的物像調清晰后移到視野中央，轉動旋轉盤移開高倍鏡，在玻片的 觀察部位滴一滴香柏油，注意此時不能移動大螺旋，再換上油鏡，使油鏡鏡頭與香柏油油滴接觸，調節小螺旋直到物像清晰。 油鏡使用完畢，必須把鏡頭和玻片標本上的香柏油擦凈。 油鏡的正確擦拭方法： （1）鏡頭的擦拭：先用擦鏡紙把鏡頭的油抹去，再用擦鏡紙蘸少許擦鏡液把鏡頭上的香柏油去掉，然后用干凈擦鏡紙擦拭干凈。擦拭時用力要輕，要順著 鏡頭的直徑方向，不要沿鏡頭的圓周涂擦。 （2）玻片標本的擦拭：先用一張擦鏡紙把標本玻片上的香柏油擦去，再滴一滴擦鏡液在擦鏡紙上，輕輕放在載玻片上向外拉，如此反復幾次便可擦凈（注 意：鏡頭和載玻片的擦拭均不能來回涂抹，且擦鏡液不能加得太多）。 （五）實驗報告 1.比較低倍鏡和高倍鏡下觀察物像有什么區別？ 2.簡述使用油鏡的注意事項。 （六）注意事項 1.取鏡時，必須右手握鏡臂，左手托鏡座，使鏡身保持平穩和直立，以免目鏡、反光鏡等滑出。 2.實驗前后，應詳細檢查顯微鏡的零件，如有損壞或丟失，應立即報告老師，切勿自行修理。嚴禁自行拆卸任何零件。 3.實驗前，應將顯微鏡擦干凈，光學及照明部分的鏡面只能用擦鏡紙擦凈，不能用手指、毛巾、紙等來涂擦，以免損壞。其他部分可用紗布擦凈。 4.使用顯微鏡的過程中切忌急躁，觀察時必須先在低倍鏡下找到物像后才能轉用高倍鏡觀察，高倍鏡找到物像后才能轉油鏡觀察。 5.顯微鏡不能在日光直射下使用。 6.顯微鏡使用完畢，轉動大螺旋上升鏡筒或下降載物臺，取下標本，轉動旋轉盤使物鏡離開通光孔，再下降鏡筒或上升載物臺使之接近物鏡。 7.畫圖時，要學會雙眼睜開，用左眼觀察，右眼畫圖，以減少眼睛的疲勞。 （葉文紅） 二、熒光顯微鏡 （―）實驗目的 1.了解熒光顯微鏡的工作原理。 2.了解熒光顯微鏡的操作步驟與注意事項。 （二）實驗原理 熒光顯微鏡（fluorescence microscope）利用一個高發光效率的點光源，經過濾色系統 發出一定波長的光作為激發光，在激發標本內的熒光物質發射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即 使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于研究細胞結構、細胞內物質的吸收、運輸及化學分布和定位（圖1-1-3）。 圖1-1-3熒光顯微鏡 （三）實驗步驟 1.用窗簾遮蔽光線，關閉房間內的燈光，除去顯微鏡的防塵罩，確保顯微鏡燈室通風良好、無遮蓋。裝上汞燈燈箱，并轉動燈箱卡圈上的撥桿，將燈箱與鏡 臂連接。 2.將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱后的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。 3.打開電源開關，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動不大于額定電壓值的±5%，即可按下啟動開關點燃汞燈，如因天氣太冷或電壓不穩定等原因，一 次啟動未點燃汞燈，可以多撳動幾次。待超高壓汞燈弧光達到穩定狀態并達到*大發光效率，即可開始工作。 4.顯微鏡的調試 （1）任選一塊標本放在載物臺上。 （2）轉動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉動濾色片組轉換手輪，將紫光（V）或藍光（B）或綠光（G）激發濾色片組轉入光路，并將10X熒光物 鏡轉入光路。 （3）調節粗微調手輪，將標本像調焦清晰。 （4）前后推動垂直照明器右邊的聚光鏡調焦推桿，使視場光闌成像清晰，轉動視場光闌撥桿將視場光闌收小，調節視場光闌調中螺釘使視場光闌居中，然 后再將視場光闌開至*大。 （
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