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分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù) 版權(quán)信息
- ISBN：9787030449269
- 條形碼：9787030449269 ; 978-7-03-044926-9
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數(shù)：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù) 內(nèi)容簡介
全書共列三十個分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及其相關(guān)附錄,內(nèi)容不僅涵蓋了基因克隆、基因表達(dá)、核酸及蛋白分子雜交等分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn),也包括基因檢測、基因打靶、RNA干擾、蛋白分析等新型的分子生物學(xué)技術(shù).每個實(shí)驗(yàn)包括原理介紹、實(shí)驗(yàn)操作、常見問題及注意事項(xiàng).在介紹原理和流程過程中,穿插一些實(shí)用的重點(diǎn)提示、試劑作用及可能出現(xiàn)的現(xiàn)象.本書所列的實(shí)驗(yàn)流程均是編者們正在使用的、在教學(xué)中進(jìn)行過實(shí)踐的、切實(shí)可行的方法;所列常見問題及注意事項(xiàng)均是多年科研工作及教學(xué)實(shí)踐的總結(jié)積累.
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù) 目錄
目錄
前言
實(shí)驗(yàn)一 DNA的提取 1
實(shí)驗(yàn)二 核酸的定量 8
實(shí)驗(yàn)三 真核細(xì)胞總RNA的提取 11
實(shí)驗(yàn)四 PCR擴(kuò)增目的基因 17
實(shí)驗(yàn)五 RT-PCR 25
實(shí)驗(yàn)六 DNA瓊脂糖凝膠電泳 31
實(shí)驗(yàn)七 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段 36
實(shí)驗(yàn)八 目的基因片段與載體的連接 39
實(shí)驗(yàn)九 用氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 42
實(shí)驗(yàn)十 重組DNA的轉(zhuǎn)化 44
實(shí)驗(yàn)十 DNA酶切 48
實(shí)驗(yàn)十二 轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定 52
實(shí)驗(yàn)十三 質(zhì)粒DNA的分離純化 55
實(shí)驗(yàn)十四 含甘油培養(yǎng)物保藏法 65
實(shí)驗(yàn)十五 Southern blot分析 67
實(shí)驗(yàn)十六 Northern blot分析 74
實(shí)驗(yàn)十七 實(shí)時定量PCR技術(shù) 78
實(shí)驗(yàn)十八 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù) 87
實(shí)驗(yàn)十九 mRNA差異顯示技術(shù) 93
實(shí)驗(yàn)二十 外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 97
實(shí)驗(yàn)二十一 SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的表達(dá) 100
實(shí)驗(yàn)二十二 Western blot檢測蛋白質(zhì)的表達(dá) 107
實(shí)驗(yàn)二十三 雙向電泳技術(shù) 114
實(shí)驗(yàn)二十四 DNA甲基化的檢測 138
實(shí)驗(yàn)二十五 哺乳動物細(xì)胞中的RNA干擾技術(shù) 141
實(shí)驗(yàn)二十六 小鼠血漿microRNA提取技術(shù) 144
實(shí)驗(yàn)二十七 DNA芯片技術(shù)檢測病原 147
實(shí)驗(yàn)二十八 TALEN載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 149
實(shí)驗(yàn)二十九 TALEN定點(diǎn)制備及篩選突變體 155
實(shí)驗(yàn)三十 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù) 157
主要參考文獻(xiàn) 163
附錄 166
前言
實(shí)驗(yàn)一 DNA的提取 1
實(shí)驗(yàn)二 核酸的定量 8
實(shí)驗(yàn)三 真核細(xì)胞總RNA的提取 11
實(shí)驗(yàn)四 PCR擴(kuò)增目的基因 17
實(shí)驗(yàn)五 RT-PCR 25
實(shí)驗(yàn)六 DNA瓊脂糖凝膠電泳 31
實(shí)驗(yàn)七 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段 36
實(shí)驗(yàn)八 目的基因片段與載體的連接 39
實(shí)驗(yàn)九 用氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 42
實(shí)驗(yàn)十 重組DNA的轉(zhuǎn)化 44
實(shí)驗(yàn)十 DNA酶切 48
實(shí)驗(yàn)十二 轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定 52
實(shí)驗(yàn)十三 質(zhì)粒DNA的分離純化 55
實(shí)驗(yàn)十四 含甘油培養(yǎng)物保藏法 65
實(shí)驗(yàn)十五 Southern blot分析 67
實(shí)驗(yàn)十六 Northern blot分析 74
實(shí)驗(yàn)十七 實(shí)時定量PCR技術(shù) 78
實(shí)驗(yàn)十八 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù) 87
實(shí)驗(yàn)十九 mRNA差異顯示技術(shù) 93
實(shí)驗(yàn)二十 外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 97
實(shí)驗(yàn)二十一 SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)的表達(dá) 100
實(shí)驗(yàn)二十二 Western blot檢測蛋白質(zhì)的表達(dá) 107
實(shí)驗(yàn)二十三 雙向電泳技術(shù) 114
實(shí)驗(yàn)二十四 DNA甲基化的檢測 138
實(shí)驗(yàn)二十五 哺乳動物細(xì)胞中的RNA干擾技術(shù) 141
實(shí)驗(yàn)二十六 小鼠血漿microRNA提取技術(shù) 144
實(shí)驗(yàn)二十七 DNA芯片技術(shù)檢測病原 147
實(shí)驗(yàn)二十八 TALEN載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 149
實(shí)驗(yàn)二十九 TALEN定點(diǎn)制備及篩選突變體 155
實(shí)驗(yàn)三十 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù) 157
主要參考文獻(xiàn) 163
附錄 166
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分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù) 節(jié)選
實(shí)驗(yàn)一 DNA的提取 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解DNA提取的基本原理，掌握DNA的提取方法。 【實(shí)驗(yàn)原理】 遺傳信息全部儲存在DNA 一級結(jié)構(gòu)之中，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。 一、分離純化DNA的原則 (1)保持DNA分子一級結(jié)構(gòu)的完整性。溫度不要過高；控制一定的pH范圍(pH5～9)，保持一定的離子強(qiáng)度，減少物理因素對核酸降解的機(jī)械剪切力。 (2)防止DNA的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。因此，所用器械和一些試劑需要高溫滅菌，提取緩沖液中也需要加核酸酶抑制劑。 二、分離提取核酸的主要步驟 （一）細(xì)胞的破碎 細(xì)胞破碎的常用方法有以下幾種。 (1)高速組織搗碎機(jī)搗碎； (2)玻璃勻漿器勻漿； (3)超聲波處理法； (4)液氮研磨法； (5)化學(xué)處理法（SDS、Tween-80等）； (6)生化法（溶菌酶、纖維素酶等）。 （二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力（核酸與堿性蛋白的結(jié)合）、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸*困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。 提取DNA的一般過程是犄分散好的組織細(xì)胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿／異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液再經(jīng)過乙醇沉淀，使DNA從溶液中析出。 蛋白酶K能在SDS和EDTA-2Na存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA-2Na則抑制細(xì)胞中DNA酶(DNase)的活性；而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。 常見的DNA酶抑制劑如下： (1)金屬離子螯合劑。DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Cap_的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-2Na等。 (2)陰離子型表面活性劑。如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中易于沉淀。 常用DNA提取原理如下。 (1)加入10倍體積的緩沖液：10 mmol/L Tris-HCI (pH 7.4)，150 mmol/L NaCI，10 mmol/L EDTA，0.50/ SDS。其中，NaCI破壞核酸一蛋白質(zhì)間的靜電引力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；EDTA破壞細(xì)胞膜、螯合Ca2_，使DNase失活；SDS可破壞細(xì)胞膜、抑制核酸酶，還可使核酸從蛋白質(zhì)上游離m來。 (2)加入蛋白酶K。蛋白酶K是一神非特異性蛋白酶，它可將蛋白質(zhì)消化成氨基酸。一般工作濃度是50--100 μg/mL。反應(yīng)時間大于5h，反應(yīng)溫度55℃。 （三）核酸的沉淀 沉淀是濃縮核酸*常用的方法。優(yōu)點(diǎn)：改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。 1．常見的用于DNA沉淀的鹽類及濃度（表1-1） 表1-1 DNA沉淀的鹽類及濃度 注：Ae代表乙酸根。 2．有機(jī)沉淀劑 (1)乙醇。優(yōu)點(diǎn)：對鹽類沉淀少，沉淀中所含少量乙醇易揮發(fā)除去。缺點(diǎn)：需要量大（2～3倍體積）。 (2)異丙醇。優(yōu)點(diǎn)：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀；異丙醇難以揮發(fā)除去。 (3)聚乙二醇(PEG)。優(yōu)點(diǎn)：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用PEG600進(jìn)行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5 mol/L的NaCI或10 mmol/L的MgCl2。 (4)精胺(spermine)。精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。原理：精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白酸雜質(zhì)與DNA的提取DNA分開，達(dá)到純化DNA的目的。 3．核酸沉淀的溫度和時間 核酸沉淀應(yīng)該在低溫下長時間進(jìn)行。若溶液中核酸濃度很高，在鹽離子存在的情況下，加入異丙醇等后即可看到DNA的絮狀沉淀。若溶液中核酸濃度很低，則需在-20℃條件下過夜。酵母tRNA可有助納克(ng)級的核酸沉淀。大于10 μg/mL的核酸，冰浴10 min即可有效沉淀。 （四）核酸的保存 1．DNA DNA樣品溶于pH 8．O的TE緩沖液中，4℃或-20℃保存，或者加1滴氯仿-70℃可保存數(shù)年。 2．RNA (1) RNA樣品溶于含0.3 mol/L NaAc (pH 5.2)的2倍體積的乙醇中，-70℃保存。 (2)在RNA溶液中加1滴氯仿或0.2 mol/L VRC（氧釩核糖核苷復(fù)合物）凍存于-70℃，可保存數(shù)年。 （五）常見基因組DNA提取方法 1．基因組DNA提取CTAB法（植物DNA提取經(jīng)典方法） 十六烷基三甲基溴化銨( hexadecVlt rimethvlammonium bro mide，CTAB)是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中(>0.7 mol/LNaCI)是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白質(zhì)，多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離m來。CTAB提取緩沖液經(jīng)典配方及改進(jìn)配方見表1-2和表1-3。 表1-2 CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 CTAB法實(shí)驗(yàn)流程見圖1-1。 2．基因組DNA提取——SDS法 SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫(55--65℃)條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸；然后，提高鹽（KAc或NHd Ac）濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS法適用于大部分實(shí)驗(yàn)材料的基因組DNA提取，如動物組織、細(xì)胞、全血、細(xì)菌、酵母等。 SDS提取緩沖液配方見表1-4。 圖1-1 CTAB法實(shí)驗(yàn)流程 表1-4 SDS提取緩沖液的配方 SDS法實(shí)驗(yàn)流程見圖1-2（以動物組織為例）。 圖1-2 SDS法實(shí)驗(yàn)流程 （六）幾種常見細(xì)胞或組織DNA的提取 1．細(xì)菌基因組DNA的制備過程 (l)細(xì)胞裂解。0.6倍體積的異丙醇或2倍體積乙醇（可以加入1/10體積的3 mol/L乙酸銨輔助沉淀）。 (2) DNA純化。CTAB除去多糖，酚氯仿一異戊醇除去蛋白質(zhì)。 (3)沉淀DNA。10% SDS和蛋白酶K。 2．哺乳動物細(xì)胞基因組DNA的抽提過程 (1)組織粉碎。動物組織剪成小塊，置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末；組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。 (2)細(xì)胞裂解。0.5% SDS和0.1 mg/mL蛋白酶K，50℃溫育。 (3)沉淀DNA。用2倍體積的無水乙醇或0.6倍體積的異丙醇（加入1/10體積的3 mol/L乙酸銨可以輔助沉淀）。 3．從植物組織中制備DNA (1)組織粉碎。用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。 (2)細(xì)胞裂解。用20/ CTAB/13-ME（十六烷基三甲基溴化銨／p巰基乙醇）或l%SDS和蛋白酶K，65℃溫育。 (3)沉淀DNA：用0.6倍體積的異丙醇（-20℃）（可以加入1/10體積的3 mol/L乙酸銨輔助沉淀）。 【實(shí)驗(yàn)用品】 1．材料 動物組織。 2．器材和儀器 (1)恒溫水浴鍋。 (2)臺式離心機(jī)。 (3)紫外分光光度計(jì)。 (4)移液器。 (5)玻璃勻漿器。 (6)離心管（滅菌）。 (7)吸頭（滅菌）等。 3．試劑 (1)細(xì)胞裂解緩沖液。 Tris (pH 8.0)100 mmol/L EDTA (pH 8.0)500 mmol/L NaCI 20 mmol/L SDS 100/L 胰RNA酶20 μg/mL (2)蛋白酶K。稱取20 mg蛋白酶K溶于1 mL滅菌的雙蒸水中，-20℃?zhèn)溆谩?(3) TE緩沖液(pH 8.0)。高壓滅菌，室溫保存。 (4)酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)。 (5)異丙醇。 (6)預(yù)冷無水乙醇。 (7) 70%乙醇。 (8)滅菌水。 (9) TIANamp Genomic DNA kit (DP 304)試劑盒。 【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】 1．方法一 (1)取新鮮或冰凍動物組織塊0.1 g(0.5 cm3)，盡量剪碎。置于研缽研碎，加入1 mL的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入蛋白酶K(500 μg/mL)20 μL，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30 min（也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24 h），間歇振蕩離心管數(shù)次。在臺式離心機(jī)上，以12 000 g離心5 min，取上清液人另一離心管中。 (2)加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100 μL吸頭挑出，晾干，用200 μL TE重新溶解（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）。 (3)加等量的酚／氯仿／異戊醇振蕩混勻，12 000 g離心5 min。 (4)取上層溶液至另一管，加入等體積的酚／氯仿／異戊醇，振蕩混勻，12 000 g離心，5 min。 (5)取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5 mol/L乙酸銨和2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2 min，12 000 g離心10 min。 (6)小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。 (7)用1 mL 70%乙醇洗滌沉淀物1次，12000 g離心5 min。 (8)小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。 (9)加200 UL TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?(10)吸取適量樣品于紫外分光光度計(jì)上檢測濃度相純度。 2．方法二 使用TIANamp Genomic DNA kit (DP 304)試劑盒提取DNA。 (1)動物組織（小于10 mg）用液氮研磨后，加入200 μL緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。 (2)加入20 ljL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，混勻，56℃放置，直到組織溶解。 (3)加入200μ L緩沖液GB，充分顛倒混合，70℃放置10 min，直到溶液變清亮。 (4)加入200 L無水乙醇，充分振蕩混合15 s。 (5)將所有溶液及絮狀沉淀加入到吸附柱CB 3中（吸附柱放人收集管中），12 000 g離心30 s，棄濾液，將吸附柱放回收集管中。 (6)向吸附柱中加入500 μL緩沖液GD，12 000 g離心30 s，棄濾液，將吸附柱放回到收集管中。 (7)向吸附柱中加入700 μL漂洗液PW，12 000 g離心30 s，棄濾液，將吸附柱放回到收集管中。 (8)向吸附柱中加入500 μL漂洗液PW，12 00
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