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醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo) 版權(quán)信息
- ISBN：9787030743923
- 條形碼：9787030743923 ; 978-7-03-074392-3
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數(shù)：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>>
醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo) 內(nèi)容簡介
《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)》是醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)等課程的實驗課指導(dǎo)用書。本書按照實驗的系統(tǒng)性，從實驗原理、材料、方法、結(jié)果、及注意事項等方面進行闡述。全書共收集了18個免疫學(xué)相關(guān)試驗，其中抗原抗體的制備、凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體參與的試驗及酶聯(lián)免疫吸附試驗，是主要闡述多克隆抗體的制備及抗原抗體反應(yīng)檢測的經(jīng)典實驗；抗體形成細(xì)胞的檢測、吞噬細(xì)胞的吞噬作用、免疫細(xì)胞分離技術(shù)及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗，主要闡述免疫細(xì)胞功能的檢測；T細(xì)胞功能的體內(nèi)測定法和豚鼠過敏試驗主要闡述體內(nèi)評估免疫功能檢測的技術(shù)等。
醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo) 目錄
目錄
實驗一 抗原抗體的制備 1
一、抗原的制備 1
二、抗體的制備 3
思考題 7
實驗二 凝集反應(yīng) 8
一、試管凝集反應(yīng) 8
二、玻片凝集反應(yīng)——ABO血型鑒定 9
三、乳膠凝集試驗 10
四、金黃色葡萄球菌協(xié)同凝集試驗 10
思考題 11
實驗三 沉淀反應(yīng) 12
一、環(huán)狀沉淀試驗 12
二、瓊脂擴散試驗 13
三、對流免疫電泳 15
四、火箭免疫電泳 16
五、免疫電泳 17
思考題 19
實驗四 補體參與的試驗 20
一、溶血素效價的測定 20
二、總補體溶血活性測定（CH50測定） 21
三、補體結(jié)合試驗 22
四、補體介導(dǎo)的微量淋巴細(xì)胞毒試驗 25
思考題 26
實驗五 酶聯(lián)免疫吸附試驗 27
一、ELISA間接法 27
二、ELISA雙抗體夾心法 28
三、斑點-ELISA（dot-ELISA） 29
四、酶標(biāo)記抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)ELISA 29
思考題 30
實驗六 抗體形成細(xì)胞的檢測 31
一、瓊脂溶血空斑技術(shù) 31
二、免疫玫瑰花試驗法 33
三、定量溶血試驗 34
思考題 34
實驗七 吞噬細(xì)胞的吞噬作用 35
一、巨噬細(xì)胞的吞噬作用（體外法） 35
二、中性粒細(xì)胞的吞噬作用（體內(nèi)法） 36
三、硝基藍(lán)四氮唑還原試驗 37
思考題 38
實驗八 溶菌酶的溶菌作用 39
思考題 40
實驗九 免疫細(xì)胞分離技術(shù) 41
一、外周血單個核細(xì)胞分離 41
二、T、B細(xì)胞的分離純化 42
三、吞噬細(xì)胞的分離 45
思考題 45
實驗十 淋巴細(xì)胞的檢測 46
一、免疫酶染法（APAAP法） 46
二、T細(xì)胞亞群免疫組化（SAP法） 47
思考題 49
實驗十一 T、B細(xì)胞膜受體的檢測 50
一、T細(xì)胞E受體的檢測——E花環(huán)試驗 50
二、B細(xì)胞FcγR的檢測——Ea花環(huán) 51
三、C3bR檢測EAC花結(jié) 52
四、B細(xì)胞SmIgM的檢測 52
思考題 53
實驗十二 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 54
一、形態(tài)學(xué)方法 54
二、3H-TdR摻入法 55
思考題 56
實驗十三 T細(xì)胞功能的體內(nèi)測定法 57
一、結(jié)核菌素試驗 57
二、PHA皮膚試驗 58
三、接觸性超敏反應(yīng) 58
思考題 59
實驗十四 豚鼠過敏試驗 60
思考題 60
實驗十五 細(xì)胞因子的檢測 61
一、ELISA直接法 61
二、雙抗體夾心法 61
思考題 61
實驗十六 人外周血CTL的細(xì)胞毒試驗——形態(tài)學(xué)檢查法 62
思考題 63
實驗十七 抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 64
思考題 65
實驗十八 人血清IgG的提取及鑒定 66
一、離子交換層析法提取人血清IgG 66
二、血清IgG整定 67
思考題 69
附錄 70
一、溶液的配制 70
二、RPMI-1640培養(yǎng)液的配制 72
三、染色液的配制 72
四、常見蛋白質(zhì)和部分溶液的光吸收值 73
五、Ig重量單位和國際單位的換算 74
實驗記錄 75
實驗一 抗原抗體的制備 1
一、抗原的制備 1
二、抗體的制備 3
思考題 7
實驗二 凝集反應(yīng) 8
一、試管凝集反應(yīng) 8
二、玻片凝集反應(yīng)——ABO血型鑒定 9
三、乳膠凝集試驗 10
四、金黃色葡萄球菌協(xié)同凝集試驗 10
思考題 11
實驗三 沉淀反應(yīng) 12
一、環(huán)狀沉淀試驗 12
二、瓊脂擴散試驗 13
三、對流免疫電泳 15
四、火箭免疫電泳 16
五、免疫電泳 17
思考題 19
實驗四 補體參與的試驗 20
一、溶血素效價的測定 20
二、總補體溶血活性測定（CH50測定） 21
三、補體結(jié)合試驗 22
四、補體介導(dǎo)的微量淋巴細(xì)胞毒試驗 25
思考題 26
實驗五 酶聯(lián)免疫吸附試驗 27
一、ELISA間接法 27
二、ELISA雙抗體夾心法 28
三、斑點-ELISA（dot-ELISA） 29
四、酶標(biāo)記抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)ELISA 29
思考題 30
實驗六 抗體形成細(xì)胞的檢測 31
一、瓊脂溶血空斑技術(shù) 31
二、免疫玫瑰花試驗法 33
三、定量溶血試驗 34
思考題 34
實驗七 吞噬細(xì)胞的吞噬作用 35
一、巨噬細(xì)胞的吞噬作用（體外法） 35
二、中性粒細(xì)胞的吞噬作用（體內(nèi)法） 36
三、硝基藍(lán)四氮唑還原試驗 37
思考題 38
實驗八 溶菌酶的溶菌作用 39
思考題 40
實驗九 免疫細(xì)胞分離技術(shù) 41
一、外周血單個核細(xì)胞分離 41
二、T、B細(xì)胞的分離純化 42
三、吞噬細(xì)胞的分離 45
思考題 45
實驗十 淋巴細(xì)胞的檢測 46
一、免疫酶染法（APAAP法） 46
二、T細(xì)胞亞群免疫組化（SAP法） 47
思考題 49
實驗十一 T、B細(xì)胞膜受體的檢測 50
一、T細(xì)胞E受體的檢測——E花環(huán)試驗 50
二、B細(xì)胞FcγR的檢測——Ea花環(huán) 51
三、C3bR檢測EAC花結(jié) 52
四、B細(xì)胞SmIgM的檢測 52
思考題 53
實驗十二 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗 54
一、形態(tài)學(xué)方法 54
二、3H-TdR摻入法 55
思考題 56
實驗十三 T細(xì)胞功能的體內(nèi)測定法 57
一、結(jié)核菌素試驗 57
二、PHA皮膚試驗 58
三、接觸性超敏反應(yīng) 58
思考題 59
實驗十四 豚鼠過敏試驗 60
思考題 60
實驗十五 細(xì)胞因子的檢測 61
一、ELISA直接法 61
二、雙抗體夾心法 61
思考題 61
實驗十六 人外周血CTL的細(xì)胞毒試驗——形態(tài)學(xué)檢查法 62
思考題 63
實驗十七 抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用 64
思考題 65
實驗十八 人血清IgG的提取及鑒定 66
一、離子交換層析法提取人血清IgG 66
二、血清IgG整定 67
思考題 69
附錄 70
一、溶液的配制 70
二、RPMI-1640培養(yǎng)液的配制 72
三、染色液的配制 72
四、常見蛋白質(zhì)和部分溶液的光吸收值 73
五、Ig重量單位和國際單位的換算 74
實驗記錄 75
展開全部
醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗指導(dǎo) 節(jié)選
實驗一抗原抗體的制備 能刺激機體免疫系統(tǒng)使之發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原（antigen，Ag）。完全抗原（如大多數(shù)蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒等）具有免疫原性和抗原性；半抗原（不完全抗原）單獨存在，只具有抗原性，而不具有免疫原性。大多數(shù)多糖、脂類和某些藥物等屬于半抗原。 在一定量抗原的刺激下，機體能產(chǎn)生特異性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），即特異性抗體？贵w是免疫學(xué)實驗中常用的材料，已知的診斷血清（抗體）常用于對抗原進行分析鑒定和定量檢測。目前人工制備的抗體有多克隆抗體、單克隆抗體（單抗）和基因工程抗體。 一、抗原的制備 大多數(shù)蛋白質(zhì)、細(xì)菌和病毒等病原微生物屬于完全抗原。按物理性狀不同又分為顆粒性抗原和可溶性抗原。 （一）細(xì)菌性抗原的制備（以傷寒桿菌H抗原和O抗原的制備為例） 【原理】 傷寒桿菌H901菌株純培養(yǎng)物經(jīng)0.4%甲醛生理鹽水于37T水浴處理一定時間，可保留其鞭毛蛋白；若加熱或用乙醇處理，則可破壞鞭毛蛋白抗原，但其菌體（O）抗原脂多糖性質(zhì)不受影響。 【材料】 1.菌株傷寒桿菌H901菌株。 2.培養(yǎng)基普通瓊脂（克氏瓶）培養(yǎng)基、普通瓊脂平板、普通瓊脂斜面培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基。 3.無菌生理鹽水、0.4%甲醛生理鹽水、無水乙醇。 4.371水浴箱、恒溫培養(yǎng)箱。 5.無菌三角瓶、試管、刻度吸管、接種環(huán)、酒精燈等。 6.布朗標(biāo)準(zhǔn)比濁管。 【方法】 1.接種經(jīng)鑒定的傷寒桿菌H901菌株至普通瓊脂平板內(nèi)，37T培養(yǎng)16～24h，挑取單個菌落轉(zhuǎn)種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)基，37T培養(yǎng)18～24h。 2.加5ml無菌肉湯培養(yǎng)基至接種有細(xì)菌的普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，靜置5～10min，搓動試管，制成細(xì)菌懸液。 3.將細(xì)菌懸液接種于克氏瓶培養(yǎng)基內(nèi)，盡量鋪平于培養(yǎng)基表面，37T培養(yǎng)16～24h。 4.用適量無菌0.4%甲醛生理鹽水沖洗刮取菌苔，移人無菌三角瓶內(nèi)，置37T水浴24h。 5.取少許經(jīng)0.4%甲醛生理鹽水處理的菌液接種于肉湯培養(yǎng)基作無菌試驗，無菌生長者用無菌生理鹽水稀釋至6億～9億菌/ml（用布朗標(biāo)準(zhǔn)比濁管測定），即獲得傷寒桿菌H抗原，41保存?zhèn)溆谩?6.用適量生理鹽水沖洗刮下克氏瓶培養(yǎng)物，移人無菌三角瓶，加等體積的無水乙醇于其中，置37T恒溫培養(yǎng)箱過夜。取少許接種肉湯培養(yǎng)基作無菌試驗。無菌生長者即傷寒桿菌O抗原菌液。41保存，臨用前，用生理鹽水將其稀釋至9億菌/ml。 【注意事項】 本實驗每個步驟都必須嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，防止造成實驗人員感染或引起實驗室污染。 （二）紅細(xì)胞抗原的制備（以綿羊紅細(xì)胞懸液的制備為例） 【原理】 綿羊紅細(xì)胞（SRBC）對家兔、小鼠等動物屬于異種抗原。采集綿羊靜脈血，抗凝，洗滌3次，除去血槳、白細(xì)胞和血小板等，即可獲得紅細(xì)胞。用生理鹽水稀釋，制成一定濃度的SRBC懸液。 【材料】 1.健康綿羊。 2.采血器材，如無菌注射器、獸用針頭、剪刀、止血帶、酒精燈、無菌棉球、2.5%碘酒、酒精等。 3.無菌三角瓶（內(nèi)盛阿氏液）、無菌離心管和吸管、橡膠吸頭、紅細(xì)胞計數(shù)器等。 4.無菌生理鹽水、水平離心機。 【方法】 1.用繩子交叉捆住綿羊四肢，使其側(cè)臥于地，剪去頸部部分毛，用止血帶扎住頸部，確定頸內(nèi)靜脈。 2.用2.5%碘酒和酒精消毒綿羊皮膚及采血者手指，持無菌注射器與頸內(nèi)靜脈呈30。角，從頭部向軀干方向進針，緩慢抽動針芯，觀察是否進人頸內(nèi)靜脈。 3.一旦抽出血液，即固定注射器，抽取30～50ml血液，迅速注人含阿氏液的無菌三角瓶內(nèi)，立即混勻，41保存，備用。 4.取適量脫纖維羊血于離心管內(nèi)，2000r/min5min，吸棄上清液及紅細(xì)胞沉積物表面的白膜，加適量無菌生理鹽水，毛細(xì)吸管吹吸幾次以混勻，再離心棄上清，重復(fù)3次。 5.*后一次離心2000r/min10min，根據(jù)血細(xì)胞比容，用無菌生理鹽水配成10%SRBC懸液。 6.取少許10%SRBC懸液再稀釋200倍，用紅細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)后，配成2.0X108個細(xì)胞/ml。 （三）可溶性抗原的制備（以人血清抗原制備為例） 【原理】 人血清中含有多種蛋白質(zhì)，根據(jù)電泳遷移率的不同，至少含有白蛋白及叫、％、P、Y球蛋白等成分。將多個個體的血清混合，則其所含的蛋白質(zhì)更為復(fù)雜。人血清可作為可溶性抗原免疫家兔，制備兔抗人全血清抗體。 【材料】 1.志愿者血清。至少10人份血清混合，原則上份數(shù)越多越好。 2.藥用天平、離心機、37T恒溫培養(yǎng)箱。 3.無菌毛細(xì)吸管、無菌三角瓶、橡膠吸頭、塑料小管等。 【方法】 1.采集的志愿者血液分別在室溫中凝固后，置于37T恒溫培養(yǎng)箱30mm，待血清析出。 2.將有凝固血的試管稱重平衡，離心2000r/min10min。用無菌毛細(xì)吸管吸出血清，集中于無菌三角瓶中，輕搖混勻。 3.將混合血清適量分裝于無菌塑料小管內(nèi)，–20℃凍存?zhèn)溆谩?【注意事項】 上述各步驟均應(yīng)無菌操作，以免人血清被污染。 二、抗體的制備 （一）多克隆抗體的制備 將上述制備的抗原經(jīng)不同途徑注人免疫動物體內(nèi)，其體內(nèi)的B細(xì)胞能分化成槳細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體。由于抗原分子具有多種抗原決定簇，每一種抗原決定簇可激活具有相應(yīng)抗原識別受體的B細(xì)胞產(chǎn)生與之相應(yīng)的抗體。因此，天然抗原誘導(dǎo)動物產(chǎn)生的抗體是針對多種抗原決定簇的抗體混合物，稱為多克隆抗體（polyclonal antibody）。 I.傷寒診斷血清的制備 【原理】 將制備好的傷寒桿菌H抗原和0抗原分別免疫健康家兔，多次注射后，家兔體內(nèi)發(fā)生再次免疫應(yīng)答，可產(chǎn)生高效價的抗H抗體和抗0抗體，這些抗體主要存在于免疫兔血清中。 【材料】 1.健康家兔（體重為2～2.5kg）。 2.傷寒桿菌H抗原和O抗原（臨用前用無菌生理鹽水洗滌3次，再用生理鹽水將傷寒桿菌稀釋成9億個/ml）。 3.無菌注射器、5號針頭、2.5%碘酒、酒精、無菌棉簽、酒精燈、三角瓶、試管、水平離心機、37T恒溫培養(yǎng)箱等。 4.無菌生理鹽水、硫柳汞。 【方法】 1.將家兔分為2組，做好標(biāo)記。免疫前分別從家兔耳緣靜脈抽血，分離血清。將血清作系列倍比稀釋后與傷寒桿菌H抗原和O抗原分別作試管凝集反應(yīng)（見實驗二“凝集反應(yīng)”），檢測家兔血清內(nèi)是否含有抗傷寒桿菌H抗原和O抗原的天然抗體，選用不含天然抗體的家兔進行免疫。 2.兔耳緣背部經(jīng)酒精消毒后，從耳緣靜脈進行免疫注射，分H抗原和O抗原兩組，如表1-1所示。 3.末次注射后7～10天試血。從耳緣靜脈抽血1～2ml，分離血清，與相應(yīng)抗原作試管凝集反應(yīng)（見實驗二“凝集反應(yīng)”）。若凝集效價達(dá)1：1280以上，即可放血。若效價偏低，再用相應(yīng)抗原3m咖強注射1～2次，可使特異性抗體效價明顯升高。 4.收集抗血清。將試血合格的免疫家兔經(jīng)心臟采血，收集血液于干燥三角瓶內(nèi)，斜置于室溫待其凝血，并置于371恒溫培養(yǎng)箱中30min，使血清析出。收集血清于離心管中，2000r/min10min，收集血清。 5.將收集的血清混勻后，再測定效價，作適量分裝，做好標(biāo)記，-201凍存?zhèn)溆；也可加人硫柳汞（終濃度為0.01%）防腐備用。 【注意事項】 從耳緣靜脈抽血前，*好先用二甲苯涂擦耳緣背部，使其充血便于進針。助手必須捏住兔耳根直至抽血完畢。 Ⅱ.溶血素的制備 【原理】 用綿羊紅細(xì)胞（SRBC）懸液免疫家兔，家兔可針對SRBC產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，合成和分泌大量抗SRBC抗體，抗SRBC抗體主要存在于被免疫家兔的血清中。在試管內(nèi)抗SRBC抗體與SRBC可發(fā)生結(jié)合，加人補體后，在一定條件下，會導(dǎo)致SRBC的溶解，故抗SRBC抗體又稱為溶血素。 【材料】 1.健康家兔（體重2～2.5kg）。 2.抗原：SRBC懸液（2.0X108個紅細(xì)胞/ml）。 3.其余材料同傷寒桿菌多克隆抗體的制備。 4.疊氮化鈉（NaN3）。 【方法】 1.如表1-2所示程序從兔耳緣靜脈進行免疫注射。 2.末次免疫后第7～10天試血。方法詳見實驗四，溶血效價達(dá)1：2000以上時，即可采血，分離血清。 3.適量分裝，做好標(biāo)記，-20T下凍存，亦可加疊氮化鈉至終濃度為0.01%，于4T中保存?zhèn)溆谩?Ⅲ.兔抗人血清的制備 【原理】 以人血清免疫家兔，可獲得兔抗人血清抗體。為使人血清能誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生高效價特異性抗體，需添加佐劑。本試驗采用弗氏完全佐劑，可使抗原在體內(nèi)緩慢釋放，延長抗原在體內(nèi)的停留時間，以獲得較佳的免疫效果。 【材料】 1.健康家兔（體重2～2.5kg）。 2.混合人血清、滅活卡介苗，青霉素、鏈霉素。 3.弗氏完全佐劑：稱取羊毛脂12g，加液體石蠟20ml，高壓蒸汽滅菌后即成為弗氏不完全佐劑。在弗氏不完全佐劑內(nèi)加人一定量的滅活卡介苗，成為弗氏完全佐劑。 4.無菌乳缽、滴管、注射器、9號針頭、2.5%碘酒、酒精、無菌棉簽等。 【方法】 1.在混合人血清中加人滅活卡介苗及青霉素、鏈霉素，混勻，此為水相（卡介苗按10mg/m咖人，青霉素、鏈霉素分別按250U/ml和250咫/m咖人）。 2.取與水相等體積的弗氏不完全佐劑置于無菌乳缽中，逐滴加人上述水相成分，朝一個方向研磨，每加1滴，都要研磨均勻后再加第2滴，直到乳缽內(nèi)形成油包水的白色乳劑；將乳劑滴加于水中完全不散開時為合格。 3.用不帶針頭的注射器吸取乳劑抗原，接上針頭后、盡量排除空氣，用無菌大試管套住注射器，于41中保存。 4.如表1-3所示免疫程序進行免疫注射。 5.末次注射后7～10天試血。用免疫兔耳緣靜脈血清為抗體，用生理鹽水作不同倍數(shù)稀釋；用12倍稀釋的混合人血清為抗原。按照沉淀反應(yīng)要求，作瓊脂雙向擴散試驗，方法詳見實驗三，以測定抗體效價。效價達(dá)1：32以上，即可心臟采血，分離并收獲抗血清。 6.做好標(biāo)記，適量分裝，–20℃；下凍存。 （二）單克隆抗體制備 【原理】 借助物理或化學(xué)手段，將2個或2個以上不同特性的細(xì)胞融合在一起，組成一個異型核（heterokaryotic）細(xì)胞，形成的細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞。如果2個細(xì)胞中有一個為瘤細(xì)胞，則融合的細(xì)胞稱為雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞具有兩親本細(xì)胞的基因，并可表達(dá)親本細(xì)胞特性。 由免疫B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞株可產(chǎn)生單一特異性、純度高的抗體。該融合細(xì)胞是經(jīng)過反復(fù)克隆而挑選出來的，由該克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體稱為單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）。一種McAb在分子結(jié)構(gòu)、氨基酸序列以及特異性等方面都是一致的。 利用雜交瘤技術(shù)制備McAb的基本原理：①淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說，即一個淋巴細(xì)胞克隆只產(chǎn)生一種抗體；②細(xì)胞融合技術(shù)所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持親代細(xì)胞雙方的特性；③利用代謝缺陷補救機制篩選出雜交瘤細(xì)胞，并進行克隆化，然后大量培養(yǎng)增殖，制備所需的McAb。 【材料】 1.實驗動物6～8周齡健康Balb/c鼠。 2.雜交瘤細(xì)胞SP2/0骨髓瘤細(xì)胞。
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