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高級(jí)酶工程 版權(quán)信息
- ISBN：9787030736147
- 條形碼：9787030736147 ; 978-7-03-073614-7
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊(cè)數(shù)：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
高級(jí)酶工程 內(nèi)容簡介
本著作作為酶工程專著，整理總結(jié)了酶工程領(lǐng)域的基本知識(shí)和近期新進(jìn)展，共設(shè)計(jì)16章，包括酶工程的發(fā)展歷史，酶的大數(shù)據(jù)挖掘方法、結(jié)構(gòu)與功能解析、設(shè)計(jì)改造方法、高效篩選方法、表達(dá)純化、級(jí)聯(lián)催化設(shè)計(jì)、人工途徑設(shè)計(jì)、催化介質(zhì)與固定化，及在生物催化、日化食品、飼料及醫(yī)藥化工等領(lǐng)域的應(yīng)用。注重前沿理論和交叉技術(shù)的融合，將酶工程新技術(shù)和新的應(yīng)用場景，新的交叉拓展領(lǐng)域囊括在本書中，諸如：計(jì)算化學(xué)、新酶設(shè)計(jì)、化學(xué)酶催化、光酶催化等與新的學(xué)科領(lǐng)域交叉取得的新的進(jìn)展，此外還將與酶學(xué)和酶工程相關(guān)的新技術(shù)應(yīng)用包括進(jìn)來，以饗讀者。
高級(jí)酶工程 目錄
目錄
第1章 酶工程發(fā)展歷程與展望 1
1.1 酶的發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)與酶工程誕生 1
1.1.1 酶的發(fā)現(xiàn)與認(rèn)識(shí) 1
1.1.2 酶的命名和分類（一基因一酶假說） 3
1.1.3 酶結(jié)構(gòu)功能與作用機(jī)制 5
1.1.4 酶的工業(yè)應(yīng)用與酶工程誕生 8
1.2 經(jīng)典生物化學(xué)時(shí)代的酶工程發(fā)展?fàn)顩r 9
1.2.1 酶的制備、分離純化與酶工程發(fā)展 9
1.2.2 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究與酶工程發(fā)展 10
1.2.3 酶的化學(xué)修飾與酶工程發(fā)展 11
1.2.4 酶的固定化研究與酶工程發(fā)展 11
1.3 分子生物學(xué)時(shí)代的酶工程發(fā)展?fàn)顩r 12
1.3.1 工具酶的發(fā)現(xiàn)和酶的異源表達(dá)生產(chǎn) 12
1.3.2 酶的定點(diǎn)突變與酶工程的發(fā)展 13
1.3.3 酶的定向進(jìn)化與酶工程的發(fā)展 14
1.3.4 基因組測序與酶的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用 15
1.4 合成生物學(xué)時(shí)代的酶工程發(fā)展?fàn)顩r 16
1.4.1 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)與酶工程發(fā)展 16
1.4.2 深度機(jī)器學(xué)習(xí)與酶的設(shè)計(jì)及應(yīng)用 16
1.5 多學(xué)科交叉融合對(duì)酶工程發(fā)展的影響 17
1.5.1 化學(xué)學(xué)科對(duì)酶工程發(fā)展的影響 17
1.5.2 材料學(xué)科對(duì)酶工程發(fā)展的影響 18
1.6 總結(jié)與展望 18
參考文獻(xiàn) 18
第2章 酶的篩選與大數(shù)據(jù)挖掘 21
2.1 環(huán)境篩選 21
2.1.1 含微生物樣品的采集 22
2.1.2 含微生物樣品的富集培養(yǎng) 24
2.1.3 產(chǎn)酶微生物的篩選 25
2.2 宏基因組挖掘 26
2.2.1 環(huán)境樣品的處理和DNA的分離 26
2.2.2 宏基因組文庫構(gòu)建 27
2.2.3 宏基因組文庫篩選 28
2.3 大數(shù)據(jù)挖掘 30
2.3.1 大數(shù)據(jù)挖掘的基本方法 30
2.3.2 相關(guān)的數(shù)據(jù)庫介紹及優(yōu)缺點(diǎn) 31
2.3.3 基于大數(shù)據(jù)的相關(guān)獲得酶基因的解析 34
2.4 酶基因合成 36
2.4.1 基因合成新技術(shù) 36
2.4.2 基因合成的理性設(shè)計(jì) 41
2.4.3 酶合成基因的表達(dá)及性能表征 43
2.5 總結(jié)與展望 46
參考文獻(xiàn) 46
第3章 酶的結(jié)構(gòu)與功能 55
3.1 酶一級(jí)序列的保守性與多樣性 55
3.1.1 一級(jí)序列氨基酸組成 56
3.1.2 一級(jí)序列氨基酸殘基的功能保守性 56
3.1.3 一級(jí)序列的遺傳多樣性 57
3.2 蛋白質(zhì)功能執(zhí)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 57
3.2.1 α螺旋 57
3.2.2 β折疊 58
3.2.3 其他二級(jí)結(jié)構(gòu) 59
3.2.4 高級(jí)結(jié)構(gòu)單元超二級(jí)結(jié)構(gòu) 60
3.3 酶的三級(jí)結(jié)構(gòu) 61
3.3.1 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素 61
3.3.2 蛋白質(zhì)折疊途徑 62
3.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法 63
3.4.1 X射線晶體衍射 63
3.4.2 核磁共振 64
3.4.3 冷凍電鏡 65
3.4.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 66
3.5 酶的構(gòu)效關(guān)系 67
3.5.1 酶結(jié)構(gòu)與功能對(duì)應(yīng)關(guān)系 68
3.5.2 酶結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)化 70
3.5.3 酶構(gòu)效關(guān)系的調(diào)控 71
3.6 酶的功能 72
3.6.1 酶催化反應(yīng)類型 73
3.6.2 酶活性口袋與識(shí)別 76
3.6.3 影響酶催化效率的因素 77
3.7 總結(jié)與展望 77
參考文獻(xiàn) 78
第4章 酶催化化學(xué)與計(jì)算解析 84
4.1 酶的化學(xué)反應(yīng)機(jī)制 84
4.1.1 酶對(duì)底物識(shí)別的分子機(jī)制 85
4.1.2 酶催化選擇性的理論分析 86
4.1.3 酶催化的化學(xué)機(jī)制 87
4.2 酶反應(yīng)機(jī)制及化學(xué)分析方法 87
4.2.1 研究酶催化反應(yīng)機(jī)制的意義 87
4.2.2 研究酶反應(yīng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)方法 89
4.2.3 研究酶反應(yīng)機(jī)制的理論方法 90
4.3 酶反應(yīng)熱力學(xué)計(jì)算 96
4.3.1 酶催化反應(yīng)的量熱學(xué) 96
4.3.2 酶反應(yīng)中的過渡態(tài)及中間體 97
4.3.3 酶反應(yīng)的熱力學(xué)計(jì)算 97
4.4 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 99
4.4.1 酶促反應(yīng)高效性的動(dòng)力學(xué)分析 100
4.4.2 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)計(jì)算 101
4.5 酶的構(gòu)效關(guān)系計(jì)算解析 102
4.5.1 影響酶反應(yīng)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素分析 102
4.5.2 酶活性中心結(jié)構(gòu)與反應(yīng)機(jī)制的理論計(jì)算 102
4.5.3 酶催化反應(yīng)構(gòu)效關(guān)系 107
4.5.4 酶的理性設(shè)計(jì) 109
4.6 總結(jié)與展望 111
參考文獻(xiàn) 111
第5章 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)方法與應(yīng)用 118
5.1 酶設(shè)計(jì)簡介 118
5.1.1 酶的理性與非理性設(shè)計(jì)歷史 118
5.1.2 蛋白質(zhì)的計(jì)算設(shè)計(jì)簡介 119
5.1.3 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)簡介 119
5.2 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)方法：策略、軟件與算法 120
5.3 酶計(jì)算設(shè)計(jì)的應(yīng)用 122
5.3.1 酶的從頭設(shè)計(jì) 122
5.3.2 酶與生物大分子的相互作用設(shè)計(jì) 124
5.3.3 酶與有機(jī)小分子的相互作用設(shè)計(jì) 126
5.3.4 金屬酶的計(jì)算設(shè)計(jì) 128
5.3.5 非催化位點(diǎn)的計(jì)算設(shè)計(jì) 129
5.3.6 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)在合成生物學(xué)中的應(yīng)用 131
5.4 酶的穩(wěn)定性設(shè)計(jì) 133
5.5 總結(jié)與展望 135
參考文獻(xiàn) 135
第6章 酶的分子改造與修飾 139
6.1 酶分子改造概述 139
6.1.1 酶分子改造歷史進(jìn)程 139
6.1.2 酶分子改造常用策略 140
6.1.3 酶改造早期應(yīng)用 141
6.2 酶的物理化學(xué)修飾 141
6.2.1 常用修飾方法 141
6.2.2 修飾原理 142
6.2.3 應(yīng)用實(shí)例 142
6.3 酶定向進(jìn)化 143
6.3.1 易錯(cuò)PCR 144
6.3.2 DNA混編 145
6.3.3 飽和突變 146
6.3.4 應(yīng)用實(shí)例 147
6.4 半理性設(shè)計(jì) 147
6.4.1 常用策略 147
6.4.2 CAST與ISM 149
6.4.3 應(yīng)用實(shí)例 151
6.5 理性設(shè)計(jì) 152
6.5.1 關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)定位 153
6.5.2 虛擬突變篩選 156
6.5.3 精簡密碼子設(shè)計(jì) 157
6.5.4 應(yīng)用實(shí)例 158
6.6 機(jī)器學(xué)習(xí) 159
6.6.1 概述 159
6.6.2 常用策略 160
6.6.3 應(yīng)用實(shí)例 161
6.7 總結(jié)與展望 163
參考文獻(xiàn) 163
第7章 酶的高效篩選 173
7.1 孔板篩選 174
7.1.1 孔板篩選的流程和策略 174
7.1.2 酶篩選底物設(shè)計(jì) 175
7.1.3 多酶級(jí)聯(lián)檢測體系 177
7.2 流式細(xì)胞儀單細(xì)胞篩選 178
7.2.1 FACS篩選策略 178
7.2.2 FACS篩選熒光底物設(shè)計(jì) 180
7.2.3 基于生物傳感器的FACS篩選 182
7.2.4 應(yīng)用實(shí)例 183
7.3 液滴微流控篩選技術(shù) 184
7.3.1 微流控芯片技術(shù)概述 184
7.3.2 基于液滴微流控技術(shù)的熒光激活液滴分選系統(tǒng) 185
7.3.3 微液滴中的酶活性熒光偶聯(lián)策略 186
7.3.4 熒光激活液滴分選的酶改造篩選應(yīng)用 188
7.4 展示技術(shù) 190
7.4.1 細(xì)胞表面展示技術(shù)及應(yīng)用實(shí)例 191
7.4.2 噬菌體展示技術(shù)及應(yīng)用實(shí)例 192
7.4.3 核糖體/mRNA展示技術(shù)及應(yīng)用實(shí)例 194
7.5 生長偶聯(lián) 195
7.5.1 生長補(bǔ)充法 197
7.5.2 利用對(duì)特定分子的抗性進(jìn)行目標(biāo)酶的篩選 197
7.5.3 噬菌體輔助的進(jìn)化技術(shù) 198
7.6 總結(jié)與展望 201
參考文獻(xiàn) 202
第8章 酶的表達(dá)與分離純化 209
8.1 概述 209
8.2 酶的微生物表達(dá) 209
8.2.1 酶生產(chǎn)菌種的要求和來源 209
8.2.2 常用微生物菌種及其研究進(jìn)展 210
8.2.3 菌株改造策略 217
8.3 發(fā)酵條件優(yōu)化 219
8.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件 219
8.3.2 發(fā)酵過程監(jiān)測傳感器與過程優(yōu)化 221
8.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化 225
8.4 酶的提取與分離純化 227
8.4.1 產(chǎn)酶料的選擇 227
8.4.2 組織和細(xì)胞的破碎 227
8.4.3 酶的抽提 228
8.4.4 酶純化工藝的建立與優(yōu)化 228
8.5 總結(jié)與展望 233
參考文獻(xiàn) 234
第9章 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)設(shè)計(jì) 239
9.1 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)概述 239
9.1.1 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)定義 239
9.1.2 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)展歷程和現(xiàn)狀 239
9.1.3 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)和所面臨的挑戰(zhàn) 240
9.2 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑設(shè)計(jì) 240
9.2.1 天然途徑的重構(gòu) 240
9.2.2 天然途徑的改造或重組 241
9.2.3 從底物到產(chǎn)物的順序推導(dǎo) 243
9.2.4 從產(chǎn)物到底物的逆合成分析 243
9.3 輔因子循環(huán)體系的設(shè)計(jì) 244
9.3.1 輔因子循環(huán)體系與代謝路徑非關(guān)聯(lián) 245
9.3.2 輔因子循環(huán)體系與代謝路徑關(guān)聯(lián) 247
9.3.3 反應(yīng)路徑和輔因子循環(huán)體系均與代謝路徑關(guān)聯(lián) 247
9.4 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑優(yōu)化 249
9.4.1 底物適配性優(yōu)化 249
9.4.2 反應(yīng)協(xié)同性優(yōu)化 250
9.4.3 環(huán)境兼容性優(yōu)化 250
9.5 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的應(yīng)用 252
9.5.1 C—H功能化形成C—X鍵 252
9.5.2 大宗化學(xué)品高值化 254
9.6 總結(jié)與展望 257
參考文獻(xiàn) 258
第10章 體外多酶分子機(jī)器 263
10.1 體外多酶分子機(jī)器概述 263
10.2 體外多酶反應(yīng)途徑的設(shè)計(jì) 265
10.2.1 天然催化途徑與非天然催化途徑 265
10.2.2 熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)途徑設(shè)計(jì) 268
10.2.3 提高底物原子經(jīng)濟(jì)性的反應(yīng)途徑設(shè)計(jì) 270
10.3 輔酶相關(guān)的體外多酶分子機(jī)器的設(shè)計(jì) 271
10.3.1 輔酶偏好性改造 271
10.3.2 輔酶再生 274
10.3.3 輔酶濃度調(diào)控 277
10.4 體外多酶分子機(jī)器的優(yōu)化 278
10.4.1 一鍋法的反應(yīng)條件優(yōu)化 279
10.4.2 分步反應(yīng) 280
10.5 體外多酶分子機(jī)器的應(yīng)用 280
10.5.1 生物燃料的體外多酶合成 281
10.5.2 糖類的體外多酶合成 282
10.5.3 手性分子的體外多酶合成 283
10.5.4 高分子聚合物的體外多酶合成 284
10.6 總結(jié)與展望 285
參考文獻(xiàn) 285
第11章 化學(xué)-酶偶聯(lián)催化 293
11.1 概述 293
11.1.1 酶催化反應(yīng)的優(yōu)勢(shì) 294
11.1.2 化學(xué)-酶偶聯(lián)催化的模式 295
11.2 分步同釜化學(xué)-酶
第1章 酶工程發(fā)展歷程與展望 1
1.1 酶的發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)與酶工程誕生 1
1.1.1 酶的發(fā)現(xiàn)與認(rèn)識(shí) 1
1.1.2 酶的命名和分類（一基因一酶假說） 3
1.1.3 酶結(jié)構(gòu)功能與作用機(jī)制 5
1.1.4 酶的工業(yè)應(yīng)用與酶工程誕生 8
1.2 經(jīng)典生物化學(xué)時(shí)代的酶工程發(fā)展?fàn)顩r 9
1.2.1 酶的制備、分離純化與酶工程發(fā)展 9
1.2.2 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究與酶工程發(fā)展 10
1.2.3 酶的化學(xué)修飾與酶工程發(fā)展 11
1.2.4 酶的固定化研究與酶工程發(fā)展 11
1.3 分子生物學(xué)時(shí)代的酶工程發(fā)展?fàn)顩r 12
1.3.1 工具酶的發(fā)現(xiàn)和酶的異源表達(dá)生產(chǎn) 12
1.3.2 酶的定點(diǎn)突變與酶工程的發(fā)展 13
1.3.3 酶的定向進(jìn)化與酶工程的發(fā)展 14
1.3.4 基因組測序與酶的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用 15
1.4 合成生物學(xué)時(shí)代的酶工程發(fā)展?fàn)顩r 16
1.4.1 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)與酶工程發(fā)展 16
1.4.2 深度機(jī)器學(xué)習(xí)與酶的設(shè)計(jì)及應(yīng)用 16
1.5 多學(xué)科交叉融合對(duì)酶工程發(fā)展的影響 17
1.5.1 化學(xué)學(xué)科對(duì)酶工程發(fā)展的影響 17
1.5.2 材料學(xué)科對(duì)酶工程發(fā)展的影響 18
1.6 總結(jié)與展望 18
參考文獻(xiàn) 18
第2章 酶的篩選與大數(shù)據(jù)挖掘 21
2.1 環(huán)境篩選 21
2.1.1 含微生物樣品的采集 22
2.1.2 含微生物樣品的富集培養(yǎng) 24
2.1.3 產(chǎn)酶微生物的篩選 25
2.2 宏基因組挖掘 26
2.2.1 環(huán)境樣品的處理和DNA的分離 26
2.2.2 宏基因組文庫構(gòu)建 27
2.2.3 宏基因組文庫篩選 28
2.3 大數(shù)據(jù)挖掘 30
2.3.1 大數(shù)據(jù)挖掘的基本方法 30
2.3.2 相關(guān)的數(shù)據(jù)庫介紹及優(yōu)缺點(diǎn) 31
2.3.3 基于大數(shù)據(jù)的相關(guān)獲得酶基因的解析 34
2.4 酶基因合成 36
2.4.1 基因合成新技術(shù) 36
2.4.2 基因合成的理性設(shè)計(jì) 41
2.4.3 酶合成基因的表達(dá)及性能表征 43
2.5 總結(jié)與展望 46
參考文獻(xiàn) 46
第3章 酶的結(jié)構(gòu)與功能 55
3.1 酶一級(jí)序列的保守性與多樣性 55
3.1.1 一級(jí)序列氨基酸組成 56
3.1.2 一級(jí)序列氨基酸殘基的功能保守性 56
3.1.3 一級(jí)序列的遺傳多樣性 57
3.2 蛋白質(zhì)功能執(zhí)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 57
3.2.1 α螺旋 57
3.2.2 β折疊 58
3.2.3 其他二級(jí)結(jié)構(gòu) 59
3.2.4 高級(jí)結(jié)構(gòu)單元超二級(jí)結(jié)構(gòu) 60
3.3 酶的三級(jí)結(jié)構(gòu) 61
3.3.1 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素 61
3.3.2 蛋白質(zhì)折疊途徑 62
3.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法 63
3.4.1 X射線晶體衍射 63
3.4.2 核磁共振 64
3.4.3 冷凍電鏡 65
3.4.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 66
3.5 酶的構(gòu)效關(guān)系 67
3.5.1 酶結(jié)構(gòu)與功能對(duì)應(yīng)關(guān)系 68
3.5.2 酶結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)化 70
3.5.3 酶構(gòu)效關(guān)系的調(diào)控 71
3.6 酶的功能 72
3.6.1 酶催化反應(yīng)類型 73
3.6.2 酶活性口袋與識(shí)別 76
3.6.3 影響酶催化效率的因素 77
3.7 總結(jié)與展望 77
參考文獻(xiàn) 78
第4章 酶催化化學(xué)與計(jì)算解析 84
4.1 酶的化學(xué)反應(yīng)機(jī)制 84
4.1.1 酶對(duì)底物識(shí)別的分子機(jī)制 85
4.1.2 酶催化選擇性的理論分析 86
4.1.3 酶催化的化學(xué)機(jī)制 87
4.2 酶反應(yīng)機(jī)制及化學(xué)分析方法 87
4.2.1 研究酶催化反應(yīng)機(jī)制的意義 87
4.2.2 研究酶反應(yīng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)方法 89
4.2.3 研究酶反應(yīng)機(jī)制的理論方法 90
4.3 酶反應(yīng)熱力學(xué)計(jì)算 96
4.3.1 酶催化反應(yīng)的量熱學(xué) 96
4.3.2 酶反應(yīng)中的過渡態(tài)及中間體 97
4.3.3 酶反應(yīng)的熱力學(xué)計(jì)算 97
4.4 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 99
4.4.1 酶促反應(yīng)高效性的動(dòng)力學(xué)分析 100
4.4.2 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)計(jì)算 101
4.5 酶的構(gòu)效關(guān)系計(jì)算解析 102
4.5.1 影響酶反應(yīng)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素分析 102
4.5.2 酶活性中心結(jié)構(gòu)與反應(yīng)機(jī)制的理論計(jì)算 102
4.5.3 酶催化反應(yīng)構(gòu)效關(guān)系 107
4.5.4 酶的理性設(shè)計(jì) 109
4.6 總結(jié)與展望 111
參考文獻(xiàn) 111
第5章 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)方法與應(yīng)用 118
5.1 酶設(shè)計(jì)簡介 118
5.1.1 酶的理性與非理性設(shè)計(jì)歷史 118
5.1.2 蛋白質(zhì)的計(jì)算設(shè)計(jì)簡介 119
5.1.3 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)簡介 119
5.2 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)方法：策略、軟件與算法 120
5.3 酶計(jì)算設(shè)計(jì)的應(yīng)用 122
5.3.1 酶的從頭設(shè)計(jì) 122
5.3.2 酶與生物大分子的相互作用設(shè)計(jì) 124
5.3.3 酶與有機(jī)小分子的相互作用設(shè)計(jì) 126
5.3.4 金屬酶的計(jì)算設(shè)計(jì) 128
5.3.5 非催化位點(diǎn)的計(jì)算設(shè)計(jì) 129
5.3.6 酶的計(jì)算設(shè)計(jì)在合成生物學(xué)中的應(yīng)用 131
5.4 酶的穩(wěn)定性設(shè)計(jì) 133
5.5 總結(jié)與展望 135
參考文獻(xiàn) 135
第6章 酶的分子改造與修飾 139
6.1 酶分子改造概述 139
6.1.1 酶分子改造歷史進(jìn)程 139
6.1.2 酶分子改造常用策略 140
6.1.3 酶改造早期應(yīng)用 141
6.2 酶的物理化學(xué)修飾 141
6.2.1 常用修飾方法 141
6.2.2 修飾原理 142
6.2.3 應(yīng)用實(shí)例 142
6.3 酶定向進(jìn)化 143
6.3.1 易錯(cuò)PCR 144
6.3.2 DNA混編 145
6.3.3 飽和突變 146
6.3.4 應(yīng)用實(shí)例 147
6.4 半理性設(shè)計(jì) 147
6.4.1 常用策略 147
6.4.2 CAST與ISM 149
6.4.3 應(yīng)用實(shí)例 151
6.5 理性設(shè)計(jì) 152
6.5.1 關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)定位 153
6.5.2 虛擬突變篩選 156
6.5.3 精簡密碼子設(shè)計(jì) 157
6.5.4 應(yīng)用實(shí)例 158
6.6 機(jī)器學(xué)習(xí) 159
6.6.1 概述 159
6.6.2 常用策略 160
6.6.3 應(yīng)用實(shí)例 161
6.7 總結(jié)與展望 163
參考文獻(xiàn) 163
第7章 酶的高效篩選 173
7.1 孔板篩選 174
7.1.1 孔板篩選的流程和策略 174
7.1.2 酶篩選底物設(shè)計(jì) 175
7.1.3 多酶級(jí)聯(lián)檢測體系 177
7.2 流式細(xì)胞儀單細(xì)胞篩選 178
7.2.1 FACS篩選策略 178
7.2.2 FACS篩選熒光底物設(shè)計(jì) 180
7.2.3 基于生物傳感器的FACS篩選 182
7.2.4 應(yīng)用實(shí)例 183
7.3 液滴微流控篩選技術(shù) 184
7.3.1 微流控芯片技術(shù)概述 184
7.3.2 基于液滴微流控技術(shù)的熒光激活液滴分選系統(tǒng) 185
7.3.3 微液滴中的酶活性熒光偶聯(lián)策略 186
7.3.4 熒光激活液滴分選的酶改造篩選應(yīng)用 188
7.4 展示技術(shù) 190
7.4.1 細(xì)胞表面展示技術(shù)及應(yīng)用實(shí)例 191
7.4.2 噬菌體展示技術(shù)及應(yīng)用實(shí)例 192
7.4.3 核糖體/mRNA展示技術(shù)及應(yīng)用實(shí)例 194
7.5 生長偶聯(lián) 195
7.5.1 生長補(bǔ)充法 197
7.5.2 利用對(duì)特定分子的抗性進(jìn)行目標(biāo)酶的篩選 197
7.5.3 噬菌體輔助的進(jìn)化技術(shù) 198
7.6 總結(jié)與展望 201
參考文獻(xiàn) 202
第8章 酶的表達(dá)與分離純化 209
8.1 概述 209
8.2 酶的微生物表達(dá) 209
8.2.1 酶生產(chǎn)菌種的要求和來源 209
8.2.2 常用微生物菌種及其研究進(jìn)展 210
8.2.3 菌株改造策略 217
8.3 發(fā)酵條件優(yōu)化 219
8.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件 219
8.3.2 發(fā)酵過程監(jiān)測傳感器與過程優(yōu)化 221
8.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化 225
8.4 酶的提取與分離純化 227
8.4.1 產(chǎn)酶料的選擇 227
8.4.2 組織和細(xì)胞的破碎 227
8.4.3 酶的抽提 228
8.4.4 酶純化工藝的建立與優(yōu)化 228
8.5 總結(jié)與展望 233
參考文獻(xiàn) 234
第9章 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)設(shè)計(jì) 239
9.1 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)概述 239
9.1.1 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)定義 239
9.1.2 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)展歷程和現(xiàn)狀 239
9.1.3 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)和所面臨的挑戰(zhàn) 240
9.2 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑設(shè)計(jì) 240
9.2.1 天然途徑的重構(gòu) 240
9.2.2 天然途徑的改造或重組 241
9.2.3 從底物到產(chǎn)物的順序推導(dǎo) 243
9.2.4 從產(chǎn)物到底物的逆合成分析 243
9.3 輔因子循環(huán)體系的設(shè)計(jì) 244
9.3.1 輔因子循環(huán)體系與代謝路徑非關(guān)聯(lián) 245
9.3.2 輔因子循環(huán)體系與代謝路徑關(guān)聯(lián) 247
9.3.3 反應(yīng)路徑和輔因子循環(huán)體系均與代謝路徑關(guān)聯(lián) 247
9.4 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑優(yōu)化 249
9.4.1 底物適配性優(yōu)化 249
9.4.2 反應(yīng)協(xié)同性優(yōu)化 250
9.4.3 環(huán)境兼容性優(yōu)化 250
9.5 體內(nèi)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的應(yīng)用 252
9.5.1 C—H功能化形成C—X鍵 252
9.5.2 大宗化學(xué)品高值化 254
9.6 總結(jié)與展望 257
參考文獻(xiàn) 258
第10章 體外多酶分子機(jī)器 263
10.1 體外多酶分子機(jī)器概述 263
10.2 體外多酶反應(yīng)途徑的設(shè)計(jì) 265
10.2.1 天然催化途徑與非天然催化途徑 265
10.2.2 熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)途徑設(shè)計(jì) 268
10.2.3 提高底物原子經(jīng)濟(jì)性的反應(yīng)途徑設(shè)計(jì) 270
10.3 輔酶相關(guān)的體外多酶分子機(jī)器的設(shè)計(jì) 271
10.3.1 輔酶偏好性改造 271
10.3.2 輔酶再生 274
10.3.3 輔酶濃度調(diào)控 277
10.4 體外多酶分子機(jī)器的優(yōu)化 278
10.4.1 一鍋法的反應(yīng)條件優(yōu)化 279
10.4.2 分步反應(yīng) 280
10.5 體外多酶分子機(jī)器的應(yīng)用 280
10.5.1 生物燃料的體外多酶合成 281
10.5.2 糖類的體外多酶合成 282
10.5.3 手性分子的體外多酶合成 283
10.5.4 高分子聚合物的體外多酶合成 284
10.6 總結(jié)與展望 285
參考文獻(xiàn) 285
第11章 化學(xué)-酶偶聯(lián)催化 293
11.1 概述 293
11.1.1 酶催化反應(yīng)的優(yōu)勢(shì) 294
11.1.2 化學(xué)-酶偶聯(lián)催化的模式 295
11.2 分步同釜化學(xué)-酶
展開全部
高級(jí)酶工程 節(jié)選
第1章 酶工程發(fā)展歷程與展望 張媛媛 王欽宏 馬延和 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 酶（enzyme）是能夠催化生物化學(xué)反應(yīng)的生物催化劑（biocatalyst），它可以使反應(yīng)的活化能降低進(jìn)而加快反應(yīng)速率。酶在化學(xué)反應(yīng)中與其他催化劑相同，不會(huì)被消耗，也不影響化學(xué)平衡。但不同之處在于酶具有更強(qiáng)的特異性（specificity）。酶的活性受到溫度、pH、溶劑、金屬離子以及其他分子［抑制劑（inhibitor）或者激活劑（activator）］的影響，會(huì)改變其結(jié)構(gòu)及催化性能。自認(rèn)識(shí)與發(fā)現(xiàn)酶以來，許多酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化開發(fā)，在醫(yī)藥、化工、食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、飼料、能源等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了廣泛應(yīng)用。作為綠色催化劑，酶完全符合現(xiàn)代安全、健康和環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。盡管酶具有無與倫比的催化特性，但是在實(shí)際應(yīng)用中，其活性、催化效率、穩(wěn)定性、底物特異性、產(chǎn)物選擇性等經(jīng)常難以滿足需求，需要對(duì)酶進(jìn)行篩選、修飾、優(yōu)化和改造以滿足工業(yè)應(yīng)用的需要。酶工程（enzyme engineering）是篩選、修飾、優(yōu)化和改造酶以獲得所需物理和催化特性的過程。在生物科學(xué)迅猛發(fā)展且與信息科學(xué)、材料、化學(xué)等多學(xué)科交叉的大環(huán)境下，不僅可以從特定環(huán)境、從生物大數(shù)據(jù)中快速獲得目標(biāo)酶，而且可以通過對(duì)特定的基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)、改造甚至從頭合成獲得理想的酶，以實(shí)現(xiàn)特定的應(yīng)用。 1.1 酶的發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)與酶工程誕生 1.1.1 酶的發(fā)現(xiàn)與認(rèn)識(shí) 人類對(duì)酶的認(rèn)知經(jīng)歷了一個(gè)不斷發(fā)展、逐步深入的過程，在這個(gè)過程中一大批科學(xué)先驅(qū)做出了杰出的貢獻(xiàn)（圖1.1）。我國和兩河流域的人們很早就開始利用酶或微生物制造酒、醬、面包等。早在6000多年前的巴比倫人就有啤酒的釀造歷史記錄，5000多年前的阿拉伯人利用羊胃膜凝乳酶制造干酪。我國利用酶的歷史也非常悠久，4000多年前的夏禹時(shí)期就掌握了釀酒技術(shù)，3000多年前的周朝已經(jīng)開始制造醬、飴糖等。然而，古代人們對(duì)酶的應(yīng)用單純依賴于觀察和重復(fù)實(shí)踐，并非利用科學(xué)技術(shù)。 圖1.1 酶的發(fā)現(xiàn)與認(rèn)識(shí)重要活動(dòng)情況 到17世紀(jì)末和18世紀(jì)初，胃分泌物對(duì)肉類的消化和唾液將淀粉轉(zhuǎn)化為糖類的過程已為人所知，但這些過程的發(fā)生機(jī)制尚未確定。1773年意大利科學(xué)家拉扎羅 斯帕蘭扎尼（Lazzaro Spallanzani，1729 — 1799年）發(fā)現(xiàn)鷹的胃液可以消化肉塊；1833 年法國化學(xué)家安塞爾姆 佩恩（Anselme Payen，1795 — 1878年）**個(gè)發(fā)現(xiàn)了淀粉酶。1857年法國科學(xué)家路易斯 巴斯德（Louis Pasteur，1822 — 1895年）在研究酵母將糖發(fā)酵成酒精時(shí)，發(fā)現(xiàn)此過程是由酵母細(xì)胞中一種稱為“發(fā)酵”的重要力量引起的，這種力量被認(rèn)為只在活生物體中發(fā)揮作用。他寫道：酒精發(fā)酵是一種與酵母細(xì)胞的生命和組織有關(guān)的行為，而不是與細(xì)胞的死亡或腐爛有關(guān)。1877年德國生理學(xué)家威廉 庫內(nèi)（Wilhelm Kühne，1837 — 1900年）首次提出“enzyme”（來自希臘文.νζυμον，其含義為“在酵母中”，中文譯為“酶”）這一術(shù)語來表述催化活性。酶這個(gè)詞后來被用來指代胃蛋白酶等非生命物質(zhì)，而發(fā)酵這個(gè)詞被用來指代生物體產(chǎn)生的化學(xué)活性。德國化學(xué)家愛德華 布赫納（Eduard Buchner，1860 — 1917年）于1897年提交了他的**篇關(guān)于酵母提取物研究的論文，發(fā)現(xiàn)即使混合物中沒有活酵母細(xì)胞，糖也會(huì)被酵母提取物發(fā)酵，他將導(dǎo)致蔗糖發(fā)酵的物質(zhì)命名為“酶”；他于1907年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，獲獎(jiǎng)的原因是他發(fā)現(xiàn)了“無細(xì)胞發(fā)酵”。 在20世紀(jì)90年代初，酶的生化特性仍然未知，許多科學(xué)家觀察到酶活性與蛋白質(zhì)有關(guān)。1926年美國生物化學(xué)學(xué)家詹姆斯 薩姆納（James Sumner，1887 — 1955年）**次將脲酶結(jié)晶從刀豆中提取出來，證實(shí)酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，這才使得之后人們對(duì)酶的蛋白質(zhì)本性和催化機(jī)制開始了深入研究，這為酶化學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，他在1937年對(duì)過氧化氫酶進(jìn)行了同樣的研究。美國生物化學(xué)家約翰 諾斯洛普（John Northrop，1891 — 1987年）和溫德爾 斯坦利（Wendell Stanley，1904 — 1971年）明確證明了純蛋白質(zhì)可以是酶的結(jié)論，他們對(duì)胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶及胃蛋白酶進(jìn)行了深入的探究，三位科學(xué)家于1946年榮獲了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。酶能夠結(jié)晶的結(jié)論*后可用X 射線晶體學(xué)分析它們的結(jié)構(gòu)來驗(yàn)證，**個(gè)獲得晶體結(jié)構(gòu)的酶是溶菌酶，溶菌酶是一種存在于眼淚、唾液和蛋清中的酶，可以消化某些細(xì)菌的外皮。該結(jié)構(gòu)是由英國結(jié)構(gòu)生物學(xué)家大衛(wèi) 菲利普斯（David Phillips，1924 — 1999年）領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)小組解析的，并于1965年發(fā)表。溶菌酶的這種高分辨率結(jié)構(gòu)標(biāo)志著結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域研究的開始，促進(jìn)在原子水平的細(xì)節(jié)上了解酶的工作原理。 20世紀(jì)80年代初期，美國科學(xué)家托馬斯 切赫（Thomas Cech，1947年 — ）和西德尼 奧爾特曼（Sidney Altman，1939年 — ）均獨(dú)自發(fā)現(xiàn)RNA能夠催化生化反應(yīng)，擁有生物催化特性，切赫將具有這一功能的物質(zhì)命名為核酶（ribozyme），也被稱為RNA催化劑。這一發(fā)現(xiàn)打破了之前僅有蛋白質(zhì)才擁有催化特性的固有認(rèn)知，因此1989年兩位科學(xué)家獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。現(xiàn)在自然環(huán)境中的很多種核酶已被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)今能夠用來反式切割靶RNA的核酶主要有發(fā)夾狀核酶、錘頭狀核酶、大腸桿菌RNase P、四膜蟲自身剪接內(nèi)含子4種核酶（Heckmann and Paradisi，2020）。 1.1.2 酶的命名和分類（一基因一酶假說） 早期主要由酶的發(fā)現(xiàn)者根據(jù)其所催化反應(yīng)的底物、反應(yīng)的類型或酶的來源來命名。例如，催化脂肪的酶命名為脂肪酶，催化蛋白質(zhì)的酶命名為蛋白酶，催化淀粉的酶命名為淀粉酶；而依據(jù)來源不同又可將蛋白酶命名為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。但有些反應(yīng)可以由幾種不同的酶催化，這些酶稱為同工酶（isozyme），而上述的命名法無法處理同工酶的情形。所以，國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟（The International Union of Biochemistry and Molecular Biology，IUBMB）頒布了酶的命名法以規(guī)范酶的命名與分類。**屆酶學(xué)委員會(huì)對(duì)酶的系統(tǒng)性和邏輯性命名問題進(jìn)行了很多思考，*后建議酶應(yīng)該有兩種命名法，一個(gè)系統(tǒng)名稱和一個(gè)習(xí)慣名稱。酶的系統(tǒng)名稱按照一定的規(guī)則形成（EC編號(hào)），盡可能準(zhǔn)確地顯示酶的作用，從而準(zhǔn)確地識(shí)別酶。每種酶由“EC”描述，后跟4個(gè)數(shù)字的序列，代表酶活性的等級(jí)（從非常普遍到非常具體）。也就是說，**個(gè)數(shù)字根據(jù)其機(jī)制對(duì)酶進(jìn)行了廣泛的分類，而其他數(shù)字則增加了越來越多的特異性。由于煩瑣，引入系統(tǒng)名稱受到強(qiáng)烈批評(píng)。酶學(xué)委員會(huì)詳細(xì)討論了這個(gè)問題，并改變了重點(diǎn)，決定在酶列表中更加突出通用名稱，它們緊跟在代碼編號(hào)之后。盡管如此，保留系統(tǒng)名稱作為分類的基礎(chǔ)還是非常必要：①在酶列表中查找酶，作為系統(tǒng)名稱的代碼編號(hào)可以更好地用于識(shí)別酶；②系統(tǒng)名稱可以更好地強(qiáng)調(diào)反應(yīng)類型；③發(fā)現(xiàn)者可以通過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則給新酶命名系統(tǒng)名稱；④新酶的通用名稱通常是系統(tǒng)名稱的縮寫形式，這樣系統(tǒng)名稱有助于找到符合一般模式的通用名稱。在發(fā)表酶不是主題的論文或報(bào)告時(shí)，一般應(yīng)使用通用名稱，但應(yīng)在**次提及時(shí)通過其代號(hào)和來源進(jìn)行識(shí)別。如果發(fā)表酶是主題的論文或報(bào)告時(shí)，則應(yīng)在首次提及時(shí)提供其代號(hào)、系統(tǒng)名稱或反應(yīng)方程式和來源；此后應(yīng)使用通用名稱。鑒于酶名稱和代號(hào)指的是催化反應(yīng)，因此提供酶的來源以進(jìn)行全面鑒定是特別重要的。當(dāng)論文或報(bào)告涉及酶列表中尚未包含的酶時(shí)，作者可以引入新名稱，如果需要，還可以引入新的系統(tǒng)名稱，兩者均根據(jù)推薦規(guī)則形成。編號(hào)只能由IUBMB的命名委員會(huì)分配。 1961年IUBMB酶學(xué)委員會(huì)依據(jù)酶的催化作用，頒布了酶的分類方法，依據(jù)酶催化生物化學(xué)反應(yīng)的類型將其分成六大類（表1.1）：連接酶、異構(gòu)酶、裂合酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、氧化還原酶（Tipton and Boyce，2000）。其中具有*豐富的酶形式的是氧化還原酶、水解酶，研究表明，現(xiàn)今在進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)60%選擇水解酶，20%選擇氧化還原酶（Straathof et al.，2002）。根據(jù)底物的化學(xué)名稱及其反應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步系統(tǒng)地劃分各個(gè)酶類別。 表1.1 酶的分類 酶的命名方法是在底物名稱后加上后綴——ase。然而，也有一些酶的名字并不包含底物名稱，如胃蛋白酶（pepsin）和胰蛋白酶（trypsin）。為避免歧義，國際酶學(xué)委員會(huì)為每種酶命名時(shí)增加了一個(gè)四級(jí)編號(hào)。**、第二、第三和第四個(gè)數(shù)字分別代表六大類酶中的某一大類、按底物類型或斷裂化學(xué)鍵劃分的亞類、按失去基團(tuán)電子受體類型劃分的亞亞類和酶的序列號(hào)。例如，乳酸脫氫酶的系統(tǒng)編號(hào)為［EC1.1.1.27］（圖1.2）。 圖1.2 酶的系統(tǒng)編號(hào)（以L- 乳酸脫氫酶為例） 酶除按照上述以酶活性（EC分類）進(jìn)行分類外，也可以按照酶的氨基酸序列相似性進(jìn)行分類。EC分類不反映序列相似性。例如，催化完全相同反應(yīng)的相同EC編號(hào)的兩個(gè)連接酶可以具有完全不同的序列。酶像任何其他蛋白質(zhì)一樣，可以根據(jù)它們的序列相似性分為許多家族，而不是按照其功能劃分，這些家族已被記錄在許多不同的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫中，如iPfam等。 1.1.3 酶結(jié)構(gòu)功能與作用機(jī)制 1. 酶的結(jié)構(gòu) 酶通常為球形蛋白質(zhì)，獨(dú)自或結(jié)合成更大的復(fù)合物來發(fā)揮其功能。酶的結(jié)構(gòu)取決于其一級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸序列），同時(shí)酶的催化活性也取決于其自身結(jié)構(gòu)。盡管結(jié)構(gòu)決定功能，但僅從結(jié)構(gòu)還不能完全預(yù)測新的酶活性。當(dāng)酶處于加熱、低pH、高pH環(huán)境或暴露于化學(xué)變性劑時(shí)，酶結(jié)構(gòu)會(huì)展開（變性），這種對(duì)結(jié)構(gòu)的破壞通常會(huì)導(dǎo)致酶活性喪失。酶變性通常與高于物種正常水平的溫度有關(guān)。因此，處于高溫環(huán)境（如溫泉等）中的物種產(chǎn)生的酶因具有在高溫下發(fā)揮作用的能力而在工業(yè)應(yīng)用上受到青睞。 酶通常比它們的底物大得多，大小范圍可以是幾十個(gè)氨基酸殘基（例如，4- 草酰巴豆酸互變異構(gòu)酶，62個(gè)殘基）到數(shù)千個(gè)氨基酸殘基（動(dòng)物脂肪酸合酶，2500多個(gè)殘基）。大多數(shù)情況下，酶只有一小部分結(jié)構(gòu)（2 ～ 4個(gè)氨基酸）直接參與催化（催化位點(diǎn)，catalytic site）。催化位點(diǎn)位于一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（binding site）旁邊；結(jié)合位點(diǎn)的殘基使底物定向，促進(jìn)催化反應(yīng)進(jìn)行。酶的活性位點(diǎn)（active site）是由結(jié)合位點(diǎn)、催化位點(diǎn)一同組成的。而活性位點(diǎn)的精準(zhǔn)定位及動(dòng)力學(xué)要依靠其他位于酶結(jié)構(gòu)中的大多數(shù)氨基酸殘基來維持。在某些酶中，沒有氨基酸直接參與催化作用；這些酶包含結(jié)合和定向催化輔助因子（cofactor）的位點(diǎn)。酶結(jié)構(gòu)也可能包含變構(gòu)位點(diǎn)（allosteric site），其中小分子的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致構(gòu)象變化，從而增加或減少酶的活性。 2. 酶的底物結(jié)合機(jī)制 酶必須先與其底物結(jié)合（substrate binding），然后才能催化反應(yīng)進(jìn)行。酶通常對(duì)它們結(jié)合的底物和催化的化學(xué)反應(yīng)非常專一。通過將具有互補(bǔ)形狀、電荷和親水/疏水特性的口袋與底物結(jié)合來實(shí)現(xiàn)特異性。因此，酶可以區(qū)分非常相似的底物分子，使其具有化學(xué)選擇性（chemoselectivity）、區(qū)域選擇性（regioselectivity）和立體特異性（stereospecificity），有些呈現(xiàn)出很高的準(zhǔn)確性與特異性。例如，參與基因復(fù)制、基因表達(dá)的酶可以發(fā)揮精確“校對(duì)”作用，DNA聚合酶等酶在**步催化反應(yīng)后，第二步檢查產(chǎn)物是否正確，這種兩步過程導(dǎo)致高保真哺乳動(dòng)物聚合酶在1億次反應(yīng)中的平均錯(cuò)誤率小于1次。相反，一些酶表現(xiàn)出泛雜性（enzyme promiscuity），具有廣泛的特異性并作用于一系列不同的相關(guān)底物。
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