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基因工程(第三版) 版權(quán)信息
- ISBN:9787030410917
- 條形碼:9787030410917 ; 978-7-03-041091-7
- 裝幀:一般膠版紙
- 冊(cè)數(shù):暫無(wú)
- 重量:暫無(wú)
- 所屬分類:>
基因工程(第三版) 內(nèi)容簡(jiǎn)介
《基因工程(第三版)》為普通髙等教育“十一五”國(guó)家*規(guī)劃教材,在前兩版多年使用的基礎(chǔ)上修訂而成。《基因工程(第三版)》按照基因工程的技術(shù)路線,對(duì)核酸的制備、基因工程工具酶、基因克隆載體、目的基因的分離與修飾、重組基因?qū)耸荏w細(xì)胞、外源目的基因表達(dá)與調(diào)控等進(jìn)行了詳細(xì)的描述。同時(shí),根據(jù)基因工程的發(fā)展趨勢(shì),對(duì)基因組改造、蛋白質(zhì)工程、代謝工程等進(jìn)行了簡(jiǎn)要的介紹。
基因工程(第三版) 目錄
第三版前言
第二版前言
**版前言
**章 核酸的制備 1
**節(jié) 核酸的組成與結(jié)構(gòu) 1
第二節(jié) 天然DNA的提取 7
第三節(jié) 天然RNA的制備 23
第四節(jié) 人工合成DNA片段 27
第五節(jié) 核酸樣品的分析與檢測(cè) 37
本章內(nèi)容提要 42
本章復(fù)習(xí)題 43
主要參考文獻(xiàn) 44
第二章 基因工程工具酶 45
**節(jié) 酶的基礎(chǔ)知識(shí) 45
第二節(jié) 限制性內(nèi)切核酸酶 48
第三節(jié) DNA連接酶 65
第四節(jié) 其他基因工程工具酶 70
本章內(nèi)容提要 79
本章復(fù)習(xí)題 80
主要參考文獻(xiàn) 80
第三章 基因克隆載體 81
**節(jié) 克隆載體的一般特性 81
第二節(jié) 原核生物基因克隆載體 82
第三節(jié) 酵母基因克隆載體 99
第四節(jié) 植物基因克隆載體 100
第五節(jié) 動(dòng)物基因克隆載體 107
第六節(jié) 人工染色體載體 114
本章內(nèi)容提要 118
本章復(fù)習(xí)題 120
主要參考文獻(xiàn) 120
第四章 目的基因的分離與修飾 121
**節(jié) 基因的基本結(jié)構(gòu)特征 121
第二節(jié) 基因組文庫(kù) 124
第三節(jié) 目的基因的分離與制備 137
第四節(jié) 基因突變與修飾 159
本章內(nèi)容提要 165
本章復(fù)習(xí)題 166
主要參考文獻(xiàn) 166
第五章 重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞 167
**節(jié) 受體細(xì)胞 167
第二節(jié) 重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞 171
第三節(jié) 重組子篩選 188
本章內(nèi)容提要 209
本章復(fù)習(xí)題 209
主要參考文獻(xiàn) 210
第六章 外源目的基因表達(dá)與調(diào)控 211
**節(jié) 外源基因表達(dá)機(jī)理 212
第二節(jié) 基因表達(dá)的調(diào)控元件 214
第三節(jié) 外源基因表達(dá)與調(diào)控 221
第四節(jié) 目的基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)與分離純化 248
本章內(nèi)容提要 257
本章復(fù)習(xí)題 258
主要參考文獻(xiàn) 259
第七章 基因組與改造 260
**節(jié) 基因組改造 260
第二節(jié) 蛋白質(zhì)工程 281
第三節(jié) 代謝工程 294
本章內(nèi)容提要 301
本章復(fù)習(xí)題 301
主要參考文獻(xiàn) 301
第八章 基因工程應(yīng)用 302
**節(jié) 基因工程在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 302
第二節(jié) 基因工程在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用 314
第三節(jié) 基因工程在能源環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用 324
第四節(jié) 基因工程在國(guó)防領(lǐng)域的應(yīng)用 328
第五節(jié) 轉(zhuǎn)基因安全及倫理 330
本章內(nèi)容提要 335
本章復(fù)習(xí)題 336
主要參考文獻(xiàn) 336
基因工程(第三版) 節(jié)選
**章 核酸的制備 核酸包括脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)和核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)兩大類。核酸是生物的遺傳物質(zhì),它決定著生物的遺傳性狀。核酸是基因工程研究的對(duì)象和原始材料,目前巳建立了一系列針對(duì)不同生物核酸的制備方法。核酸制備的基本操作過(guò)程包括生物材料的準(zhǔn)備、細(xì)胞的裂解、DNA或RNA的提取與純化,以及對(duì)核酸樣品的檢測(cè)與分析。 **節(jié)核酸的組成與結(jié)構(gòu) 為了有效地制備核酸分子,并在后續(xù)的基因工程操作中準(zhǔn)確地掌握相關(guān)操作技術(shù),首先要了解核酸的相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)。 一、DNA的組成與結(jié)構(gòu) (一)DNA的組成 DNA是一類由4種脫氧核苷酸按照一定的順序聚合而成的生物大分子。例如,人的各條染色體DNA分子平均含有約1.3X108個(gè)堿基對(duì)(bp)。即使是一些很小的質(zhì)粒,它的 DNA分子也含有成千個(gè)堿基對(duì),如從藍(lán)藻中分離出的一種小質(zhì)粒pPbS就含有1511bp。 脫氧核苷酸分子由脫氧核糖、磷酸和堿基組成。脫氧核糖的**位置碳原子(1')上連接一個(gè)堿基,第五位置碳原子(5')上連接一個(gè)磷酸基團(tuán)。脫氧核苷酸的5'磷酸基團(tuán)和另外一個(gè)脫氧核苷酸的3'羥基結(jié)合形成磷酸二酯鍵,把兩個(gè)脫氧核苷酸連接在一起。按此方式把一個(gè)一個(gè)脫氧核苷酸連接成多聚脫氧核苷酸,其一端為游離的5'磷酸基團(tuán)(5'-P),稱為5端;而另一端為游離的3羥基(3-OH),稱為3端(圖1-1)。 組成DNA的堿基有腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4種,分別含有這4種堿基的脫氧核苷酸依次稱為腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸和胸腺嘧啶脫氧核苷酸。多聚脫氧核苷酸鏈中,各個(gè)脫氧核苷酸的脫氧核糖和磷酸基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和位置是一致的,不同的只是堿基。因此在多聚脫氧核苷酸鏈中,堿基的順序表示脫氧核苷酸的序列。例如,從5'端開(kāi)始依次由鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷酸、腺嘌呤脫氧核苷酸和胸腺嘧啶脫氧核苷酸連接成的寡聚核苷酸鏈可用堿基5'-GCCAT-3'表示。 (二)DNA的空間結(jié)構(gòu) DNA通常以兩條相同的多聚脫氧核苷酸鏈反向結(jié)合的形式存在,兩條脫氧核苷酸鏈總是按照堿基A與T互補(bǔ)配對(duì)、G與C互補(bǔ)配對(duì),通過(guò)氫鍵形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu),稱為雙鏈DNA (dsDNA,圖1-1)。而單獨(dú)存在的一條多聚脫氧核苷酸鏈稱為單鏈DNA (ssDNA).自然界存在的DNA絕大部分是雙鏈DNA,只有部分病毒和噬菌體及絕少數(shù)質(zhì)粒的DNA是單鏈DNA。 由于雙鏈DNA中堿基是互補(bǔ)配對(duì)的,所以當(dāng)一條鏈的核苷酸序列巳知時(shí),另外一條鏈的核苷酸序列也就可以知道。為便于書寫,雙鏈DNA的核苷酸序列往往以5,—3,走向的單鏈DNA的核苷酸序列表示。例如,DNA片段 5'-GATCATGCCATC-3' 3'-CTAGTACGGTAG-5' 可寫成5'-GATCATGCCATC-3'。 圖1-1 DNA的一段多聚脫氧核苷酸鏈?zhǔn)疽鈭D 根據(jù)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的螺距和旋轉(zhuǎn)方向不同,可以分為B-DNA、A DNA、Z DNA。但生物體內(nèi)的DNA絕大部分是以B-DNA形式存在的。因此,如果沒(méi)有專門說(shuō)明是哪一種 DNA,一般所說(shuō)的DNA是指B-DNA。B-DNA的空間結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1-2。 由于雙鏈DNA是靠互補(bǔ)配對(duì)的堿基之間的氫鍵維持的,因此當(dāng)溶解在溶液中的雙鏈 DNA處于較高溫度條件下時(shí),氫鍵斷開(kāi)而解鏈成單鏈DNA,此過(guò)程稱為DNA變性。DNA 溶液加熱到90°C時(shí),就足以使DNA完全變性。DNA達(dá)到50%變性的溫度稱為解鏈溫度(Tm)。Tm與DNA分子中G+C的含量成正相關(guān)。高溫變性的DNA被逐漸冷卻時(shí),分開(kāi)的兩條單鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈DNA,此過(guò)程稱為復(fù)性。在復(fù)性條件下,即使不是同一個(gè) DNA分子變性產(chǎn)生的兩條單鏈,只要它們之間的堿基序列大部分是互補(bǔ)的,同樣可以復(fù)性。甚至DNA與RNA之間,如果序列中堿基互補(bǔ)(除G與C配對(duì)外,RNA的U與DNA的 A配對(duì)),復(fù)性條件下也同樣可以互相結(jié)合,成為雙鏈雜交分子。 (三)DNA在生物體內(nèi)的存在狀態(tài) 處于生物體內(nèi)的DNA稱為天然DNA,包括染色體DNA、病毒DNA (噬菌體DNA)、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA等,有的以線形存在,有的以環(huán)狀存在。幾乎所有真核生物的染色體DNA都是線形DNA,部分原核生物的染色體DNA也是以線形存在的。而大部分原核生物的染色體DNA和全部線粒體DNA、葉綠體DNA及細(xì)菌的質(zhì)粒DNA全是環(huán)狀DNA分子。病毒和噬菌體中有的含線形DNA,有的含環(huán)狀DNA。X噬菌體的DNA 處在噬菌體顆粒內(nèi)時(shí)是線形的,當(dāng)X噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)胞后,脫去外殼,兩端連接就成為環(huán)狀的DNA分子。環(huán)狀DNA分子一般以超螺旋形式存在,稱為超螺旋DNA (supercoiled DNA,sc-DNA)或共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA (covalently closed circular DNA,cccDNA);當(dāng) DNA —條鏈的一個(gè)憐酸二醋鍵斷開(kāi)時(shí),則成為開(kāi)環(huán)DNA分子(open circle DNA,oc-DNA);而當(dāng)兩條鏈中相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)磷酸二酯鍵同時(shí)斷開(kāi)時(shí),則成為線形DNA分子(linear DNA,1-DNA)。提取的質(zhì)粒DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)時(shí),凝膠上經(jīng)常可以同時(shí)觀察到 ccc-DNA、 oc-DNA 和1-DNA。 (四)DNA的生物學(xué)功能 1.DNA是遺傳信息庫(kù) 每個(gè)DNA分子編碼著為數(shù)不等的各種基因(gene)。基因是DNA分子中一個(gè)由多個(gè)核苷酸按特定排列順序組成的DNA區(qū)段,是遺傳物質(zhì)的*小功能單位,決定著生物體內(nèi)某種蛋白質(zhì)和RNA的合成。一個(gè)DNA分子可編碼多個(gè)基因,一般而言原核生物的DNA分子編碼的基因數(shù)少,真核生物的DNA分子編碼的基因數(shù)多。因此,DNA分子是絕大部分生物(RNA病毒除外)遺傳信息的載體,儲(chǔ)存著決定這些生物不同物種的所有蛋白質(zhì)和RNA 的全部遺傳信息,使其在不同時(shí)間和空間有序地合成生物體的相關(guān)組分,為其生命周期自始至終有序地進(jìn)行和個(gè)性發(fā)展奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 2.DNA能轉(zhuǎn)錄RNA 一個(gè)DNA分子中,有的核苷酸序列(RNA基因)轉(zhuǎn)錄出rRNA,成為核糖體的一部分;有的核苷酸序列(RNA基因)轉(zhuǎn)錄出tRNA,在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中轉(zhuǎn)運(yùn)氣基酸;有的核苷酸序列(結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄出mRNA,把DNA的遺傳信息傳遞給以后翻譯合成的蛋白質(zhì)。此外,在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中往往還出現(xiàn)種種小RNA分子。但是DNA分子中還有一部分核苷酸序列是不轉(zhuǎn)錄任何RNA的,特別是高等真核生物染色體DNA分子中的大部分核苷酸序列是不轉(zhuǎn)錄任何RNA的。行使轉(zhuǎn)錄RNA的DNA核苷酸序列有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄區(qū)兩部分。轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(promoter,P)是指DNA上一段能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄區(qū)從轉(zhuǎn)錄RNA的起錄點(diǎn)開(kāi)始,包括基因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。所有生物從*低等的病毒直至人類,蛋白質(zhì)合成都使用同一套遺傳密碼(表1-1),只有極少數(shù)例外,也就是說(shuō)遺傳密碼是通用的。重組的DNA分子不管導(dǎo)人什么樣的生物細(xì)胞中,只要具備轉(zhuǎn)錄翻譯的條件,其上面的遺傳密碼均能轉(zhuǎn)錄翻譯出同樣的氨基酸。即使人工合成的 DNA分子(基因),其上面的遺傳密碼同樣可以轉(zhuǎn)錄翻譯出相應(yīng)的氨基酸。 表1-1 編碼氨基酸的通用遺傳密碼子 3. DNA分子能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制 在細(xì)胞分裂之前,細(xì)胞內(nèi)的DNA分子能進(jìn)行半保留復(fù)制(semi conservation replica-tion)。復(fù)制過(guò)程中,親代雙鏈DNA分子的每一條鏈準(zhǔn)確地按核苷酸互補(bǔ)配對(duì)原則,在 DNA聚合酶催化下各合成一條新的互補(bǔ)鏈,由此產(chǎn)生的兩個(gè)新DNA分子的核苷酸序列與原來(lái)的DNA分子完全相同。復(fù)制結(jié)束后,兩個(gè)新DNA分子分別進(jìn)人分裂后的子細(xì)胞內(nèi),每個(gè)子細(xì)胞內(nèi)的DNA分子攜帶著同細(xì)胞分裂前親代細(xì)胞內(nèi)的DNA分子完全一樣的遺傳信息。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制,可使DNA攜帶的遺傳信息精確地傳代,除非是在 DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生了突變。DNA的復(fù)制是邊解鏈邊合成的,總是從特定的位點(diǎn)起始,將此位點(diǎn)稱為復(fù)制起始位點(diǎn)(n),這對(duì)于DNA復(fù)制是不可缺少的。大多數(shù)原核生物的染色體DNA分子只有一個(gè)on位點(diǎn),而真核生物染色體DNA分子中有多個(gè)on。從復(fù)制起始位點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制出一個(gè)DNA分子或一個(gè)DNA片段的核苷酸序列稱為一個(gè)復(fù)制單位,或一個(gè)復(fù)制子。只有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)的DNA分子,整個(gè)DNA分子就是一個(gè)復(fù)制子。而真核生物染色體DNA分子中有多個(gè)on,所以DNA分子的復(fù)制是由多個(gè)復(fù)制子共同完成的。染色體外遺傳物質(zhì),包括病毒(噬菌體)DNA分子、線粒體DNA分子、葉綠體DNA分子和質(zhì)粒DNA分子中一般只有一個(gè)ori,因此這些DNA分子是單復(fù)制子的。但是這些DNA分子可多次復(fù)制,所以在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)是多拷貝的。大多數(shù)DNA的復(fù)制是雙向的,有些病毒(如腺病毒、中29噬菌體等)及線粒體DNA的復(fù)制是單向進(jìn)行的。 二、RNA的組成與結(jié)構(gòu) RNA是一類重要的生物大分子,其組成類似于DNA,由4種核苷酸按照一定的順序聚合而成。不同于DNA之處在于其核苷酸組成成分之一不是脫氧核糖而是核糖;組成RNA 的4種堿基中,胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)所替代。RNA分子在生物體內(nèi)一般是單鏈的,但是往往通過(guò)堿基配對(duì)原則形成一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)乃至三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)行使生物學(xué)功能。 在生物體內(nèi)的RNA主要有基因組DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA (mRNA)、核糖體RNA (rRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (RNA),在蛋白質(zhì)的生物合成中起著重要作用。此外,生物體內(nèi)還有不均一核RNA (HnRNA)、小核RNA (SnRNA)和小核仁RNA (SnoRNA)等。一切細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都含有RNA。此外,在部分病毒和一些噬菌體中也存在RNA,作為它們的遺傳物質(zhì)。 (一)mRNA mRNA (messenger RNA,信使RNA)在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中起著十分重要的作用,它是細(xì)胞內(nèi)將遺傳信息從DNA上傳遞到功能蛋白上的信使,是連接遺傳信息與蛋白質(zhì)合成的橋梁。基因的遺傳信息首先在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中從DNA轉(zhuǎn)錄到mRNA上,再以mRNA為模板按三聯(lián)體密碼將mRNA中的核苷酸順序表達(dá)為蛋白質(zhì)(多肽)中的氨基酸(圖1-3)。所以生物體中穩(wěn)定的mRNA是決定基因表達(dá)水平的一個(gè)重要因素,但是細(xì)胞內(nèi)的mRNA —般是很不穩(wěn)定的,代謝活躍,更新迅速,壽命短促。 圖1-3 蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程 細(xì)胞中mRNA的含量雖然只占RNA總量的1%~5%,但是mRNA的種類繁多,一個(gè)哺乳類動(dòng)物的細(xì)胞中就有成千上萬(wàn)種不同的mRNA分子。mRNA分子的大小也千差萬(wàn)別,小的只有幾百個(gè)核苷酸,大的可達(dá)2萬(wàn)多個(gè)核苷酸。而且mRNA的結(jié)構(gòu)在原核生物和真核生物細(xì)胞中是不完全一樣的。 真核細(xì)胞的一個(gè)mRNA分子一般只攜帶一種肽鏈編碼信息,合成一種多肽鏈,屬于單順?lè)醋拥男问健U婧松锏膍RNA通常是先在細(xì)胞核內(nèi)由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA前體(核不均-RNA,HnRNA),然后再經(jīng)過(guò)加工,成為成熟的mRNA,過(guò)膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞質(zhì)中成熟的真核生物mRNA的結(jié)構(gòu),一般是5,端有帽子結(jié)構(gòu)和非翻譯前導(dǎo)序列,3,端含非翻譯序列和多聚腺苷酸[poly(A)]“尾巴”中間為翻譯區(qū)(編碼區(qū))(圖1-4)。“帽子”由7-甲基鳥(niǎo)嘌呤及三磷酸鳥(niǎo)苷組成,具有促進(jìn)核蛋白體與mRNA結(jié)合和加速翻譯起始速度的作用,也起著增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性的作用。非翻譯前導(dǎo)序列位于翻譯起始密碼子AUG之前,通常是不翻譯的。poly(A)“尾巴”長(zhǎng)度為20~200個(gè)腺苷酸,是以無(wú)模板的方式添加的,與mRNA從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位及mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)。真核生物 mRNA的半衰期為1~2
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