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園藝分子生物學實驗技術(創新型現代農林院校研究生系列教材科學出版社十三五普通高等教育研究生規劃教材) 版權信息
- ISBN：9787030725714
- 條形碼：9787030725714 ; 978-7-03-072571-4
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
園藝分子生物學實驗技術(創新型現代農林院校研究生系列教材科學出版社十三五普通高等教育研究生規劃教材) 內容簡介
《園藝分子生物學實驗技術》是在1995年為研究生開設的“現代生物技術”課程的基礎上，吸收了生物技術發展的新技術與內容，*終編寫而成的。 全書共分12章，以園藝作物為研究對象，系統地介紹了核酸分離提取技術、基因克隆及表達分析技術、電泳及目的基因克隆測序、DNA分子標記技術、分子雜交技術、差異表達基因篩選技術、基因功能研究技術、基因調控研究技術、CRISPR/Cas9基因組編輯技術、細胞工程技術、轉基因研究技術和植菌互作研究的可視化技術等的原理、方法與應用。 本書可作為本科生、研究生學習分子生物學的教科書，也可作為從事園藝分子生物學研究工作的研究生、科研及實驗技術人員的參考用書。
園藝分子生物學實驗技術(創新型現代農林院校研究生系列教材科學出版社十三五普通高等教育研究生規劃教材) 目錄
目錄
第1章核酸分離提取技術1
1.1脫氧核糖核酸（DNA）的分離提取1
1.2核糖核酸（RNA）的分離提取4
第2章基因克隆及表達分析技術8
2.1聚合酶鏈式反應（PCR）技術8
2.2cDNA末端快速擴增法（RACE）10
2.3啟動子染色體步移法13
2.4實時熒光定量PCR技術17
第3章電泳及目的基因克隆測序21
3.1高等植物DNA瓊脂糖凝膠電泳21
3.2目的基因DNA片段回收與載體連接22
3.3大腸桿菌感受態細胞制備24
3.4DNA轉化與重組克隆篩選鑒定25
第4章DNA分子標記技術27
4.1隨機擴增多態性DNA（RAPD）分子標記27
4.2限制性片段長度多態性（RFLP）分子標記29
4.3擴增片段長度多態性（AFLP）分子標記32
4.4相關序列擴增多態性（SRAP）分子標記36
4.5簡單序列重復（SSR）分子標記39
4.6單核苷酸多態性（SNP）分子標記41
4.7分子標記輔助選擇技術44
第5章分子雜交技術47
5.1DNA印跡法47
5.2RNA印跡法51
5.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質54
5.4蛋白質印跡法59
5.5原位雜交64
第6章差異表達基因篩選技術72
6.1植物mRNA差異顯示技術72
6.2抑制消減雜交技術75
6.3RNA-seq技術83
6.4調控轉錄因子基因的microRNA預測87
6.5microRNA定量分析90
第7章基因功能研究技術95
7.1超量表達技術95
7.2RNAi技術98
7.3亞細胞定位102
第8章基因調控研究技術105
8.1酵母雙雜交技術105
8.2雙分子熒光互補技術107
8.3免疫共沉淀技術111
8.4蛋白質體外結合（pulldown）技術114
8.5酵母單雜交技術119
8.6雙熒光素酶報告基因檢測技術123
8.7電泳遷移率變動分析（EMSA）技術126
8.8染色質免疫沉淀（ChIP）技術130
第9章CRISPR/Cas9基因組編輯技術134
9.1靶點的選擇與載體的構建134
9.2靶點編輯效率的預評估139
9.3遺傳轉化142
9.4突變體的鑒定146
第10章細胞工程技術149
10.1離體快繁技術149
10.2器官再生技術151
10.3胚挽救育種技術155
10.4多倍體檢測技術158
第11章轉基因研究技術161
11.1農桿菌介導的胚性愈傷組織的轉基因技術161
11.2農桿菌介導的不定芽培養技術164
11.3農桿菌介導的體細胞胚瞬時轉化技術——以葡萄體細胞胚為例166
11.4基因槍法介導的洋蔥表皮細胞瞬時轉化技術169
第12章植菌互作研究的可視化技術172
12.1熒光蛋白標記172
12.2碘化丙啶（PI）熒光染料染色174
12.3臺盼藍染色176
12.4苯胺藍染色178
12.5二氨基聯苯胺（DAB）染色179
主要參考文獻182
第1章核酸分離提取技術1
1.1脫氧核糖核酸（DNA）的分離提取1
1.2核糖核酸（RNA）的分離提取4
第2章基因克隆及表達分析技術8
2.1聚合酶鏈式反應（PCR）技術8
2.2cDNA末端快速擴增法（RACE）10
2.3啟動子染色體步移法13
2.4實時熒光定量PCR技術17
第3章電泳及目的基因克隆測序21
3.1高等植物DNA瓊脂糖凝膠電泳21
3.2目的基因DNA片段回收與載體連接22
3.3大腸桿菌感受態細胞制備24
3.4DNA轉化與重組克隆篩選鑒定25
第4章DNA分子標記技術27
4.1隨機擴增多態性DNA（RAPD）分子標記27
4.2限制性片段長度多態性（RFLP）分子標記29
4.3擴增片段長度多態性（AFLP）分子標記32
4.4相關序列擴增多態性（SRAP）分子標記36
4.5簡單序列重復（SSR）分子標記39
4.6單核苷酸多態性（SNP）分子標記41
4.7分子標記輔助選擇技術44
第5章分子雜交技術47
5.1DNA印跡法47
5.2RNA印跡法51
5.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質54
5.4蛋白質印跡法59
5.5原位雜交64
第6章差異表達基因篩選技術72
6.1植物mRNA差異顯示技術72
6.2抑制消減雜交技術75
6.3RNA-seq技術83
6.4調控轉錄因子基因的microRNA預測87
6.5microRNA定量分析90
第7章基因功能研究技術95
7.1超量表達技術95
7.2RNAi技術98
7.3亞細胞定位102
第8章基因調控研究技術105
8.1酵母雙雜交技術105
8.2雙分子熒光互補技術107
8.3免疫共沉淀技術111
8.4蛋白質體外結合（pulldown）技術114
8.5酵母單雜交技術119
8.6雙熒光素酶報告基因檢測技術123
8.7電泳遷移率變動分析（EMSA）技術126
8.8染色質免疫沉淀（ChIP）技術130
第9章CRISPR/Cas9基因組編輯技術134
9.1靶點的選擇與載體的構建134
9.2靶點編輯效率的預評估139
9.3遺傳轉化142
9.4突變體的鑒定146
第10章細胞工程技術149
10.1離體快繁技術149
10.2器官再生技術151
10.3胚挽救育種技術155
10.4多倍體檢測技術158
第11章轉基因研究技術161
11.1農桿菌介導的胚性愈傷組織的轉基因技術161
11.2農桿菌介導的不定芽培養技術164
11.3農桿菌介導的體細胞胚瞬時轉化技術——以葡萄體細胞胚為例166
11.4基因槍法介導的洋蔥表皮細胞瞬時轉化技術169
第12章植菌互作研究的可視化技術172
12.1熒光蛋白標記172
12.2碘化丙啶（PI）熒光染料染色174
12.3臺盼藍染色176
12.4苯胺藍染色178
12.5二氨基聯苯胺（DAB）染色179
主要參考文獻182
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園藝分子生物學實驗技術(創新型現代農林院校研究生系列教材科學出版社十三五普通高等教育研究生規劃教材) 節選
第1章 核酸分離提取技術 1.1 脫氧核糖核酸（DNA）的分離提取 1.1.1 實驗目的 脫氧核糖核酸（ DNA）作為生命的遺傳物質，其雙螺旋結構的發現對生物學具有里程碑的意義，不僅使生命科學進入分子生物學的時代，而且使生物技術得到更好的發展完善。當今的生物學可以進行從一個基因到一個基因家族的研究，進一步到宏觀的基因組學研究。 DNA提取在植物生物化學研究中至關重要，基因分離與功能研究、遺傳轉化體系建立研究、轉基因研究、基因作用機理研究及分子標記等都以 DNA的提取為前提。因此，有效分離提取高質量的植物 DNA是植物基因工程研究的基礎。 植物組織含有較多的次生代謝產物如酚類、萜類、色素和多糖，這些物質給 DNA的分離、提取與純化帶來較多的困難，影響了 DNA分析與基因研究的結果。在動植物 DNA的研究過程中，科研人員相繼探索出十二烷基硫酸鈉（ SDS）法、氯化銫法等 DNA分離方法，但存在成本高、污染大且效率低等缺點。在眾多的 DNA提取方法中， CTAB法具有成本低、效率高、操作便捷等特點，逐漸成為植物 DNA提取的常用手段。本節以葡萄葉片為材料，以 CTAB法為例，通過介紹 DNA提取的原理與步驟，詳細闡述 DNA的分離提取和純化技術，其目的是了解 DNA分離提取的技術原理，掌握操作流程。 1.1.2 實驗原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法的原理是首先裂解植物細胞，釋放植物 DNA，進而利用有機溶劑進行多次抽提，使蛋白質、多糖等變性沉淀，色素等有機物保留在有機溶劑中，而 DNA保留在水相中，昀終分離得到較純凈的 DNA。不同的 DNA提取方法、提取效率不同。在瓊脂糖凝膠電泳中根據 DNA條帶的亮度和清晰度可判斷 DNA的產量、質量及完整性。在植物 DNA的提取過程中， CTAB的作用主要有兩點：①破壞植物細胞膜，將植物 DNA從細胞中釋放到緩沖液中；②與多糖和蛋白質結合，使蛋白質變性，有利于 DNA與變性蛋白質及多糖的分離。通過這兩個特性，達到提取和分離 DNA的目的。乙二胺四乙酸（ EDTA）是二價金屬離子的螯合劑，可螯合溶液中的 Mg2＋、Ca2＋，抑制 DNase酶對 DNA的降解作用。 Tris-HCl是常用的緩沖溶液，可使得 DNA穩定存在于適宜 pH的緩沖環境中。聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）和 β-巰基乙醇可防止植物細胞中的酚類物質氧化成醌類物質，防止它們與 DNA不可逆地結合，干擾提取分離效果。氯仿∶異戊醇可以溶解溶液中的色素，使蛋白質進一步變性析出并與 DNA分離，其中異戊醇作為消泡劑，可以使有機相與水相充分混刀。在高鹽溶液——乙酸鈉溶液中，離子鍵切斷 DNA與蛋白質等大分子的結合，而且乙酸鈉溶液中的 Na＋可中和 DNA分子所帶的負電荷，消除 DNA分子間的靜電斥力，防止其他大分子化合物與 DNA的結合。乙醇攜帶的羥基可以與 DNA分子上的 H＋結合，使 DNA分子脫水，疏水基團裸露出來，促使 DNA析出。 1.1.3 實驗用品 1．材料新鮮幼嫩的葡萄葉片。 2．儀器和用具研缽、水浴鍋、2mL離心管、 15mL離心管、容量瓶、渦旋儀、離心機、電泳儀、凝膠成像儀、紫外分光光度計、冰箱、移液器等。 3．試劑 1）CTAB提取液：將 4g CTAB、16.364g NaCl、20mL 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）、8mL0.5mol/L EDTA加入約 70mL的 ddH2O中，定容至 200mL并高溫滅菌。 2）20% PVP（聚乙烯吡咯烷酮）：取 20g PVP粉末用 ddH2O充分溶解，定容至 100mL并高壓滅菌。 3）氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V）：96mL氯仿（三氯甲烷）加 4mL異戊醇混刀。 4）75% 乙醇（ V/V）：75mL無水乙醇與 25mL ddH2O混合。 5）Tris-HCl溶液（ 1mol/L，pH8.0）：將 31.528g Tris-HCl溶于 200mL ddH2O中，調節 pH為 8.0后高溫滅菌。 6）EDTA溶液（ 0.5mol/L，pH8.0）：將 18.61g Na2EDTA 2H2O與 2g NaOH粉末溶于 100mL ddH2O中，調節 pH為 8.0。 7）1×TE溶液（ pH8.0）：取 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）1mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）0.2mL，加 ddH2O定容至 100mL。 8）乙酸鈉溶液（3mol/L，pH5.2）：取 408.1g的三水合乙酸鈉溶解于約 800mL ddH2O中，用冰醋酸調節 pH至 5.2，并定容到 1L。高壓滅菌后室溫保存。 9）乙酸銨溶液（1mol/L，pH4.5）：乙酸銨 7.7g，加 50mL水溶解后，加冰醋酸調 pH至 4.5，需用冰醋酸約 6mL，用 ddH2O定容至 100mL。 10）5×TBE電泳緩沖液母液：取 54g Tris，27.5g硼酸（ boric acid），0.5mol/L EDTA（pH8.0）20mL，加水定容至 1000mL。工作液為 0.5×TBE，使用時用蒸餾水稀釋 10倍。 11）其他試劑：無水乙醇、氯仿∶辛醇（ 24∶1）混合液、聚乙烯聚吡咯烷酮（ PVPP）、 RNase、β-巰基乙醇、 5mol/L NaCl、核酸染料、液氮、瓊脂糖等。 1.1.4 操作步驟 1．植物 DNA的分離提取（ CTAB法） 方法一 1）預熱 CTAB提取液（ 65℃水浴）：配制后的 CTAB提取液放置時間長會有晶體析出，可 65℃加熱溶解。 2）取約0.1g新鮮幼嫩的葡萄葉片在研缽中用液氮快速研磨至粉末。 3）將粉末轉移至2mL無菌離心管中，快速加入 750μL CTAB提取液、20μL β-巰基乙醇、100μL PVP溶液（20%）并渦旋振蕩至充分混刀。 4）在 65℃水浴 30min，其間每隔 10min顛倒混刀一次。 5）加入與上清液等體積（約 700μL）的氯仿∶異戊醇（ 24∶1），充分混刀。 6）12 000r/min下離心 10min，將上清液轉移至新的 2mL無菌離心管中。 7）加入等體積（約700μL）的氯仿∶異戊醇（ 24∶1），充分混刀。 8）12 000r/min下離心 10min，小心吸取上清液至新的 2mL無菌離心管中。 9）加入2倍體積的無水乙醇上下顛倒混刀，室溫下靜置 30min。 10）用吸頭將白色絮狀 DNA挑取至干凈的 2mL無菌離心管中，加 1mL 75%乙醇清洗 DNA 2次。 11）將乙醇溶液倒掉，晾干，使乙醇徹底揮發，加入 200μL 1×TE充分溶解 DNA。方法二 為便于實驗操作，可簡化實驗步驟，參照 Doyle（1987）的方法略加修改如下： 1）新鮮幼嫩的葡萄葉片 0.5g置于研缽中，加入 5mL液氮，研磨成細粉狀，待解凍后加入 5mL CTAB提取液。研磨成均刀的混合液后，轉入 15mL離心管中，置于 65℃水浴鍋中水浴 30min。 2）取出離心管，置于室溫下冷卻；加入 50mg聚乙烯聚吡咯烷酮（ PVPP）和等體積的氯仿∶辛醇混合液（ 24∶1），搖刀后，在 8000r/min下離心 10min。 3）將上清液移入另一潔凈的 15mL離心管中，加入 5mol/L NaCl 2mL后，再加入 2倍體積預冷的無水乙醇（ 0℃），輕輕混刀，置入－20℃冰箱中 1h或過夜。 4）挑出似棉絮狀的小團，用乙酸鈉/乙醇溶液（10mmol/L乙酸鈉，76%乙醇）洗滌30min后，在 10mmol/L乙酸銨中洗滌 30s，提取的 DNA溶于 200μL的 TE溶液［10mmol/L Tris（pH8.0），250mmol/L EDTA］中備用。 5）DNA濃度用 1%瓊脂糖凝膠電泳估測，電極緩沖液用 TBE［10.8g Tris（pH8.0），5.5g硼酸，0.5mol/L EDTA 4mL，加水稀釋至 1000mL］溶液。 2．植物 DNA的檢測 1）瓊脂糖凝膠制備：稱取適量瓊脂糖，加入 0.5×TBE溶液，加熱配制成 1%的瓊脂糖凝膠并加入核酸染料如溴化乙錠（ EB）等，冷卻凝固后轉移至電泳槽。 2）取適量DNA樣品，加入 10×上樣緩沖液與 ddH2O配制至總體積 10μL，用移液器轉移至凝膠點樣孔。 3）電泳后在凝膠成像儀中進行觀察，質量好的 DNA應在凝膠中呈現單一亮帶（圖 1-1A）。 4）取 2μL DNA樣品，用紫外分光光度計測定 DNA濃度和質量，純凈的 DNA樣品 OD260/OD230≥2且 OD260/OD280≈1.8。OD260/OD280＜1.8說明有蛋白質污染， OD260/OD280＞1.8說明有 RNA污染。 3．植物 DNA的純化 1）粗提的 DNA在電泳檢測時可以看到 DNA條帶和降解不完全的 RNA（圖 1-1A），加入 RNase，在 37℃下保持 30min即可去除樣品中的 RNA（圖 1-1B）。 圖 1-1葡萄葉片基因組 DNA提取 A．RNase消化之前的 DNA樣品；B．RNase消化之后的 DNA樣品 2）給去除RNA的 DNA樣品中加入 10%體積的 3mol/L乙酸鈉，輕輕搖刀 10s左右。 3）給上述DNA樣品加入 2倍體積預冷的無水乙醇，輕輕搖刀后，靜置或者放在－20℃冰箱里 1h或者過夜，將漂浮在冷乙醇里的似棉絮狀的小團挑出，用預冷的無水乙醇反復洗滌 3次后，挑出棉絮狀的小團，置于另一潔凈的離心管里，側壁使預冷的無水乙醇流出，用潔凈的吸水紙吸去預冷的無水乙醇，待 5min左右，加入 200μL的 TE溶液［10mmol/L Tris（pH8.0），250mmol/L EDTA］，形成純化的模板 DNA備用。 1.1.5 注意事項 1）盡量選用較幼嫩的植物組織，如植物的幼芽與幼葉。一是細胞中的核酸占據主導地位；二是細胞處于發育早期，可減少多糖、酚類、蛋白質等大分子物質的影響。 2）研磨時首先使用液氮速凍提取組織，保持絕對冷凍低溫，使組織細胞里的 DNA固定，防止 DNA降解，使組織變硬，便于充分研磨，以保證 DNA的提取質量。 3）核酸染料EB有誘變劑作用，操作時應注意個人防護，及時收集用過的染料，防止污染環境。 4）氯仿∶異戊醇進行抽提時離心時間可長些，取上清時保持靜置，不要觸及下層；應用氯仿、 β-巰基乙醇等化學試劑時應在通風櫥中進行，做好個人防護，防止污染環境。 5）整個流程操作應盡量輕柔，不要劇烈搖晃，防止 DNA斷裂。 1.2 核糖核酸（RNA）的分離提取 1.2.1 實驗目的 細胞中的總 RNA包括 mRNA、rRNA、tRNA和 sRNA，其中有 80%～85%的 rRNA， 15%～20%的 tRNA和 sRNA，1%～5%的 mRNA。分子生物學中研究基因表達、信號轉導、基因調控和轉錄組分析等都需要從植物中分離出高純度且未降解的 RNA。本實驗的目的是掌握從園藝作物中提取、純化核糖核酸（ RNA）的方法并測定 RNA量。 1.2.2 實驗原理 實驗室中常用的 RNA提取方法較多，主要包括苯酚法、強變性劑法、陰離子去污劑法、LiCl-尿素法等。這些方法的共同原理是先提取總核酸，然后再選擇性地分離出 RNA。
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