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微生物生物學實驗教程 版權信息
- ISBN：9787030417343
- 條形碼：9787030417343 ; 978-7-03-041734-3
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
微生物生物學實驗教程 內容簡介
實驗內容包括顯微鏡的使用方法；多種典型細菌、放線菌、酵母菌和絲狀真菌的細胞形態觀察；細菌特殊結構的觀察，細菌的常用的染色技術，如細菌的革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色及鞭毛染色等；噬菌體效價測定；顯微鏡下測量酵母菌體的大小和數量；微生物生理、生化指標的常規檢測，營養和環境因素（溫度、pH值、紫外線和抗生素等）對微生物的生長，微生物培養基的制備及培養基、器皿等幾種不同類型的滅菌技術，土壤中微生物的選擇性篩選；微生物菌種保藏等微生物學基礎實驗。
微生物生物學實驗教程 目錄
目錄
總序
前言
實驗規則
第—章 顯微技術 1
實驗一 亮視野顯微鏡的使用 1
實驗二 暗視野顯微鏡的使用 6
實驗三 相差顯微鏡的使用 9
實驗四 熒光顯微鏡的使用 13
實驗五 趨磁細菌細胞及其磁小體形態的透射電鏡觀察 15
第二章 微生物的形態觀察 21
實驗六 細菌的簡單染色 21
實驗七 細菌的革蘭氏染色 24
實驗八 細菌的芽胞染色 27
實驗九 細菌莢膜染色 30
實驗十 細菌的鞭毛染色及其運動性觀察 32
實驗十一 細菌的抗酸性染色 35
實驗十二 放線菌的形態觀察 39
實驗十三 酵母菌形態及子囊孢子的觀察 44
實驗十四 毛霉與根霉的形態觀察 48
實驗十五 青霉、曲霉及鐮刀菌的形態觀察 53
第三章 微生物的純培養技術 57
實驗十六 幾種常見培養基的制備 57
實驗十七 高壓蒸汽滅菌和干熱滅菌 64
實驗十八 厭氧細菌的培養技術 67
第四章 營養因素與環境條件對微生物生長的影響 75
實驗十九 營養元素對微生物生長的影響 75
實驗二十 溫度對微生物生長的影響 77
實驗二十一 pH對微生物生長的影響 79
實驗二十二 紫外線對微生物生長的影響 81
實驗二十三 化學藥劑對微生物生長的影響 84
第五章 應用微生物技術 87
實驗二十四 噬菌體效價的測定 87
實驗二十五 微生物對大分子物質的水解 91
實驗二十六 微生物對糖的利用 94
實驗二十七 顯微鏡下微生物細胞的直接計數 96
實驗二十八 顯微鏡下微生物細胞大小的測量 98
實驗二十九 大腸桿菌生長曲線及其代時測定 101
實驗三十 環境中微生物的檢測 104
實驗三十一 稀釋法分離土壤微生物 107
實驗三十二 環境中大腸菌群的測定 110
實驗三十三 自然乳酸發酵及其菌株和產物的檢測 117
實驗三十四 微生物菌種保藏技術 124
附錄Ⅰ 常用培養基及試劑 130
附錄Ⅱ 常用染液 139
附錄Ⅲ MPN檢索表 143
實驗部分照片舉例
總序
前言
實驗規則
第—章 顯微技術 1
實驗一 亮視野顯微鏡的使用 1
實驗二 暗視野顯微鏡的使用 6
實驗三 相差顯微鏡的使用 9
實驗四 熒光顯微鏡的使用 13
實驗五 趨磁細菌細胞及其磁小體形態的透射電鏡觀察 15
第二章 微生物的形態觀察 21
實驗六 細菌的簡單染色 21
實驗七 細菌的革蘭氏染色 24
實驗八 細菌的芽胞染色 27
實驗九 細菌莢膜染色 30
實驗十 細菌的鞭毛染色及其運動性觀察 32
實驗十一 細菌的抗酸性染色 35
實驗十二 放線菌的形態觀察 39
實驗十三 酵母菌形態及子囊孢子的觀察 44
實驗十四 毛霉與根霉的形態觀察 48
實驗十五 青霉、曲霉及鐮刀菌的形態觀察 53
第三章 微生物的純培養技術 57
實驗十六 幾種常見培養基的制備 57
實驗十七 高壓蒸汽滅菌和干熱滅菌 64
實驗十八 厭氧細菌的培養技術 67
第四章 營養因素與環境條件對微生物生長的影響 75
實驗十九 營養元素對微生物生長的影響 75
實驗二十 溫度對微生物生長的影響 77
實驗二十一 pH對微生物生長的影響 79
實驗二十二 紫外線對微生物生長的影響 81
實驗二十三 化學藥劑對微生物生長的影響 84
第五章 應用微生物技術 87
實驗二十四 噬菌體效價的測定 87
實驗二十五 微生物對大分子物質的水解 91
實驗二十六 微生物對糖的利用 94
實驗二十七 顯微鏡下微生物細胞的直接計數 96
實驗二十八 顯微鏡下微生物細胞大小的測量 98
實驗二十九 大腸桿菌生長曲線及其代時測定 101
實驗三十 環境中微生物的檢測 104
實驗三十一 稀釋法分離土壤微生物 107
實驗三十二 環境中大腸菌群的測定 110
實驗三十三 自然乳酸發酵及其菌株和產物的檢測 117
實驗三十四 微生物菌種保藏技術 124
附錄Ⅰ 常用培養基及試劑 130
附錄Ⅱ 常用染液 139
附錄Ⅲ MPN檢索表 143
實驗部分照片舉例
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微生物生物學實驗教程 節選
**章 顯微技術 實驗一 亮視野顯微鏡的使用 一、實驗目的 1.熟悉普通亮視野顯微鏡的構造及各部分的功能。 2.學習并掌握油鏡的工作原理及正確的使用方法。 二、實驗原理 (一)顯微鏡的基本構造 普通亮視野顯微鏡是一種精密的光學儀器，通常能將物體放大1500～2000倍。它的構造可分為兩大部分：一為機械裝置，二為光學系統（圖1-1)，只有這兩部分很好地配合使用，才能發揮顯微鏡的作用。 圖1-1 普通亮視野顯微鏡的成像原理示意圖 1.機械裝置 普通亮視野顯微鏡的機械裝置部分包括：鏡座、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、推動器、粗調螺旋、細調螺旋。 2.光學系統 普通亮視野顯微鏡的光學系統包括：光源、物鏡、聚光器、目鏡。 顯微鏡的物鏡使被檢物體**次成像，物鏡成像的質量對顯微鏡的分辨率有著決定性的作用。物鏡的性能取決于物鏡的數值孔徑（numerical aperture，NA)，每個物鏡的數值孔徑都標在物鏡的外殼上，數值孔徑越大，物鏡的性能越好。根據物鏡放大率的高低，可分為①低倍物鏡：指l×～6×，NA值為0.04～0.15。②中倍物鏡：指6×～25×，NA值為0.15～0.40。③高倍物鏡：指25×～63×，NA值為0.35～0.95。④油鏡：指90×～lOO×，NA值為1.25～1.40。 聚光器安裝在載物臺下，其作用是將光源經反光鏡反射來的光線聚焦于樣品上，以得到*強的照明，使物像獲得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以調節，使焦點落在被檢物體上，以得到*大亮度。 目鏡的作用是把物鏡放大了的物像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結構較物鏡簡單，普通光學顯微鏡的目鏡通常由兩塊透鏡組成，上端的透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場鏡”。 (二）光學顯微鏡的成像原理 顯微鏡的放大功能是通過透鏡來完成的，單透鏡成像具有像差，影響像質。由單透鏡組合而成的透鏡組相當于一個凸透鏡，放大作用更好。圖1-1是顯微鏡的成像原理模式。 (三）顯微鏡的性能 顯微鏡分辨能力的高低決定于光學系統的各種條件。被觀察的物體必須放大率高，而且清晰。物體放大后，能否呈現清晰的細微結構，首先取決于物鏡的性能，其次為目鏡和聚光器的性能。 1.數值孔徑 數值孔徑也稱鏡口率（或開口率)，簡寫為NA，在物鏡和聚光器上都標有數值孔徑。數值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數，也是判斷它們性能的*重要指標。數值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切關系，它與顯微鏡的分辨率成正比；與焦深成反比；與鏡像亮度的平方根成正比。 數值孔徑（NA)可用下式表示： NA=n sina 式中，n——物鏡與標本之間的介質折射率； a——*大入射角的半數，即物鏡的鏡口角的半數。所謂鏡口角是指從物鏡光軸上的物點發出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度，見圖1-2。 圖1-2 物鏡的光線入射角 鏡口角總是小于180。。因為空氣的折射率為1，所以干燥物鏡的數值孔徑總是小于1，一般為0.05～0.95；油鏡如用香柏油（折射率為1.515)浸沒，則數值孔徑*大可接近1.5。雖然理論上數值孔徑的極限等于所用浸沒介質的折射率，但實際上從透鏡的制造技術看，是不可能達到這一極限的。通常在實用范圍內，高級油鏡的*大數值孔徑是1.4。 幾種物質的介質的折射率如下：空氣為1.0，水為1.33，玻璃為1.5，甘油為1.47，香柏油為1.52。 介質折射率對物鏡光線通路的影響見圖1-3。 圖1-3 物鏡干燥系（A)與油浸系（B)的光線通路 2.分辨率（D) 分辨率D可用下式表示。 可見光的波長a為0.4～0.7pm，平均波長為0.55pm。這也是肉眼所能感受的光波的平均長度。若用數值孔徑為0.65的物鏡，則0=0.55/(2×0.65)=0.42um。這表示被檢物體長度在0.42um以上時可見，若小于0.42um就不可見。如果使用數值孔徑為1.25的油鏡時，則D=0.55/(2×1.25)=0.22pm，凡被檢物體長度大于這個數值，均可見。由此可見，D值越小，分辨率越高，物像越清晰。根據上式，可通過：①減低波長；②增大折射率；③加大鏡口角來提高分辨率。紫外線作光源的顯微鏡和電子顯微鏡就是利用短光波來提高分辨率以檢視較小物體的。物鏡分辨率的高低與造像是否清楚有密切關系；目鏡沒有物鏡所具有的這種性能，目鏡只放大物鏡所造的像。 3.放大率 顯微鏡放大物體，首先經過物鏡**次放大造像，目鏡在明視距離造成第二次放大像。放大率就是*后的像和原物體兩者體積大小之比。因此，顯微鏡的放大率(V)等于物鏡放大率（K)和目鏡放大率（F2)的乘積，即。 4.焦深 在顯微鏡下觀察一個標本時，焦點對在某一像面時，物像*清晰，這像面為目的面。在視野內除目的面外，還能在目的面的上面和下面看見模糊的物像，這兩個面之間的距離稱為焦深。物鏡的焦深和數值孔徑及放大率成反比，即數值孔徑和放大率越大，焦深越小。因此調節油鏡比調節低倍鏡要更加仔細，否則容易使物像滑過而找不到。 三、實驗材料 光學顯微鏡、擦鏡紙、吸水紙、無水乙醚：無水乙醇（3：1)混合液或二甲苯置于雙層瓶中。 四、實驗步驟 顯微鏡結構精密，使用時必須細心，要按下述操作步驟進行。 1.觀察前的準備 (1)顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內拿出時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩地將顯微鏡搬運到實驗桌上。 (2)將顯微鏡放在自己身體的左前方，距離桌子邊緣約10cm，右側可放記錄本或繪圖紙。 (3)將10×物鏡轉入光路，將聚光器上的虹彩光圈打開到*大位置。打開電源，用雙眼觀察目鏡中視野的亮度，通過調節電流旋鈕來調節光照強弱，使視野的光照達到*明亮*均勻為止。 (4)調節光軸中心，在使用顯微鏡進行觀察時，其光學系統中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一條直線上。 2.低倍鏡觀察 鏡檢任何標本都要養成必須先用低倍鏡觀察的習慣。因為低倍鏡視野較大，易于發現目標和確定檢查的位置。 將標本片放置在載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器，使被觀察的標本處在物鏡正下方，轉動粗調螺旋，使物鏡調至接近標本處，用目鏡觀察并同時用粗調螺旋慢慢升起鏡筒（或下降載物臺），直至物像出現，再用細調螺旋使物像清晰。用推動器移動標本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進行觀察。 3.高倍鏡觀察 在低倍物鏡觀察的基礎上轉換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉換不應碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號的物鏡，在轉換物鏡時要從側面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調節光照，使亮度適中，緩慢調節粗調螺旋，使載物臺上升（或鏡筒下降)，直至物像出現，再用細調螺旋調至物像清晰，找到需觀察的部位，并移至視野中央進行觀察。 4.油鏡觀察 油鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內，再加上一般光學顯微鏡的油鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油鏡時要特別細心，避免由于“調焦”不慎而壓碎標本片并使物鏡受損。 5.油鏡的使用 (1)先用粗調螺旋將鏡筒提升（或將載物臺下降）約2cm，并將高倍鏡轉出。 (2)在玻片標本的鏡檢部位滴上1滴香柏油。 (3)從側面注視，用粗調螺旋將載物臺緩緩地上升（或鏡筒下降)，使油鏡浸入香柏油中，直至鏡頭幾乎與標本接觸。 (4)從接目鏡內觀察，放大視場光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場光闌油鏡開大視場光闌），上調聚光器，使光線充分照明。用粗調螺旋將載物臺徐徐下降（或鏡筒上升)，當出現物像一閃后改用細調螺旋調至*清晰。如油鏡已離開油面而仍未見到物像，必須再從側面觀察，重復上述操作。 (5)觀察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許無水乙醚：無水乙醇（3：1)混合液或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，*后再用擦鏡紙擦拭2～3下即可（注意：要向一個方向擦拭，同時不要過量使用二曱苯，以免其殘留在鏡頭上影響觀察)。 (6)將各部分還原，轉動物鏡轉換器，使物鏡頭不與載物臺通光孔相對，而是成“八”字形位置，再將鏡筒下降至*低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。*后用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分，然后將顯微鏡放回柜內或鏡箱中。 五、實驗結果 學會光學顯微鏡的使用，并學會對不同微生物示范片（如細菌、真菌）進行觀察。 六、思考題 1.請說出雙層瓶中液體的成分和用途，用光學顯微鏡觀察細菌制片時吸水紙和擦鏡紙各有什么用途？ 2.為什么在觀察細菌制片時多使用油鏡？使用油鏡時應注意些什么？如何清理？ 3.如何確定光學顯微鏡中圖像的放大倍數？什么是顯微鏡的分辨率？光學顯微鏡*大的分辨率一般是多少？ 4.你在實驗過程中使用過何種顯微鏡？通常有幾種型號的物鏡？如何區分？它們的放大倍數一般是多少？請說出在觀察下列微生物形態時，應使用多大放大倍數的物鏡頭？ A.大腸桿菌 B.酵母菌 C.藍細菌 D.曲霉 E.黑化鏈霉菌 七、參考文獻 劉國生.2007.微生物學實驗技術.北京：科學出版社 Madigan M T，Martinko J M，Stahl D A，et al.2012.Brock Biology of Microorganism.13th ed.Boston Benjamin Cummings 實驗二 暗視野顯微鏡的使用 一、實驗目的 1.學習暗視野顯微鏡的工作原理及使用方法，了解其應用范圍。 2.掌握使用暗視野顯微鏡觀察微生物樣品形態及細菌運動性的基本技術。 二、實驗原理 暗視野顯微鏡工作的基本原理是丁達爾效應：當一束光線透過黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現一條光亮的灰塵“通路”。暗視野顯微鏡是在普通亮視野顯微鏡的結構基礎上改造而成的，它使用專用的聚光鏡，其中央有擋光片，使照明光線不能由下而上地通過直射進入物鏡，從而使光改變路徑，只有被標本反射和衍射的光線從周邊進入物鏡（圖2-1)，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的（圖2-2)。 圖2-1 暗視野顯微鏡與亮視野顯微鏡工作原理對比及擋片的形態示意圖（引自：Omoto et al.，1999)
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