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生物化學與分子生物學實驗教程(第2版) 版權信息
- ISBN：9787030485779
- 條形碼：9787030485779 ; 978-7-03-048577-9
- 裝幀：一般膠版紙
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
生物化學與分子生物學實驗教程(第2版) 內容簡介
本實驗教程分為三部分：**部分介紹了生物化學與分子生物學實驗的基本知識與理論，包括生物化學與分子生物學實驗基本知識、生物化學實驗基本技術理論、分子生物學實驗基本技術理論、生物化學與分子生物學專業常用數據庫及其應用；第二部分為生物化學與分子生物學實驗操作，共精選了50個生物化學與分子生物學具體實驗；第三部分為附錄，列出了常用生物化學與分子生物學試劑的配制方法。
生物化學與分子生物學實驗教程(第2版) 目錄
目錄
**篇生物化學與分子生物學實驗基本知識與理論
**章生物化學與分子生物學實驗基本知識1
一、實驗室基本規則1
二、實驗室基本操作2
三、實驗樣品的制備6
四、實驗誤差與數據處理8
五、實驗記錄與實驗報告13
第二章生物化學實驗基本技術理論15
一、分光光度技術15
二、層析技術21
三、電泳技術37
四、離心技術44
第三章分子生物學實驗基本技術理論49
一、重組DNA技術49
二、核酸分子雜交技術53
三、聚合酶鏈反應技術59
四、蛋白質印跡技術65
第四章生物化學與分子生物學專業常用數據庫及其應用68
一、常用數據庫68
二、常用分析工具76
三、真核基因啟動子區生物信息學分析87
四、microRNA靶標的預測92
第二篇生物化學與分子生物學實驗操作
第五章生物化學實驗操作97
實驗1蛋白質的兩性反應與等
電點測定97
實驗2蛋白質的沉淀反應99
實驗3蛋白質的熱變性101
實驗4雙縮脲法測定蛋白質含量103
實驗5Folin-酚試劑法測定蛋白質含量105
實驗6考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量107
實驗7紫外吸收法測定蛋白質含量109
實驗8BCA法測定蛋白質含量111
實驗9凱氏定氮法測定蛋白質含量112
實驗10乙酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白115
實驗11SDS-PAGE蛋白電泳117
實驗12蛋白質雙向電泳121
實驗13單向上行紙層析分離氨基酸123
實驗14轉氨基作用與氨基酸的紙層析125
實驗15凝膠柱層析分離蛋白質127
實驗16動物肝臟DNA的分離提取、鑒定及含量測定131
實驗17動物組織RNA的分離提取、鑒定及含量測定133
實驗18溫度對酶活性的影響134
實驗19酸堿度對酶活性的影響136
實驗20抑制劑和激活劑對酶活性的影響137
實驗21尿淀粉酶活性的測定139
實驗22酶反應速度與米氏常數測定141
實驗23血糖（葡萄糖）的測定145
實驗24血清甘油三酯的測定147
實驗25血清膽固醇的測定148
實驗26血清高密度脂蛋白膽固醇及其亞組分測定153
實驗27血清尿素氮含量測定（改良二乙酰一肟法）155
實驗28血液和尿中肌酐含量測定156
第六章分子生物學實驗操作159
實驗29質粒DNA的提取159
實驗30質粒DNA的酶切及電泳160
實驗31DNA片段的回收162
實驗32DNA片段的連接164
實驗33感受態細菌的制備166
實驗34重組DNA的轉化與篩選167
實驗35外源基因在大腸桿菌中的誘導表達170
實驗36常規PCR171
實驗37逆轉錄-聚合酶鏈反應173
實驗38實時定量PCR176
實驗39DNA的分子雜交——Southern印跡178
實驗40RNA的分子雜交——Northern印跡182
實驗41蛋白質的免疫印跡——Western印跡185
實驗42cDNA文庫的構建187
實驗43熒光素酶報告基因檢測啟動子活性192
實驗44電泳遷移阻滯實驗195
實驗45染色質免疫沉淀實驗201
實驗46酵母雙雜交實驗205
實驗47RNA干擾實驗210
實驗48蛋白質免疫共沉淀實驗216
實驗49RNA免疫共沉淀實驗218
實驗50GSTpull-down實驗220
附錄222
附錄1化學試劑分級與注意事項222
附錄2常用緩沖液的配制223
附錄3硫酸銨飽和度計算表229
附錄4常用培養基及抗生素的配制231
附錄5離心機轉速（r/min）與相對
離心力（RCF）的換算234
**篇生物化學與分子生物學實驗基本知識與理論
**章生物化學與分子生物學實驗基本知識1
一、實驗室基本規則1
二、實驗室基本操作2
三、實驗樣品的制備6
四、實驗誤差與數據處理8
五、實驗記錄與實驗報告13
第二章生物化學實驗基本技術理論15
一、分光光度技術15
二、層析技術21
三、電泳技術37
四、離心技術44
第三章分子生物學實驗基本技術理論49
一、重組DNA技術49
二、核酸分子雜交技術53
三、聚合酶鏈反應技術59
四、蛋白質印跡技術65
第四章生物化學與分子生物學專業常用數據庫及其應用68
一、常用數據庫68
二、常用分析工具76
三、真核基因啟動子區生物信息學分析87
四、microRNA靶標的預測92
第二篇生物化學與分子生物學實驗操作
第五章生物化學實驗操作97
實驗1蛋白質的兩性反應與等
電點測定97
實驗2蛋白質的沉淀反應99
實驗3蛋白質的熱變性101
實驗4雙縮脲法測定蛋白質含量103
實驗5Folin-酚試劑法測定蛋白質含量105
實驗6考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量107
實驗7紫外吸收法測定蛋白質含量109
實驗8BCA法測定蛋白質含量111
實驗9凱氏定氮法測定蛋白質含量112
實驗10乙酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白115
實驗11SDS-PAGE蛋白電泳117
實驗12蛋白質雙向電泳121
實驗13單向上行紙層析分離氨基酸123
實驗14轉氨基作用與氨基酸的紙層析125
實驗15凝膠柱層析分離蛋白質127
實驗16動物肝臟DNA的分離提取、鑒定及含量測定131
實驗17動物組織RNA的分離提取、鑒定及含量測定133
實驗18溫度對酶活性的影響134
實驗19酸堿度對酶活性的影響136
實驗20抑制劑和激活劑對酶活性的影響137
實驗21尿淀粉酶活性的測定139
實驗22酶反應速度與米氏常數測定141
實驗23血糖（葡萄糖）的測定145
實驗24血清甘油三酯的測定147
實驗25血清膽固醇的測定148
實驗26血清高密度脂蛋白膽固醇及其亞組分測定153
實驗27血清尿素氮含量測定（改良二乙酰一肟法）155
實驗28血液和尿中肌酐含量測定156
第六章分子生物學實驗操作159
實驗29質粒DNA的提取159
實驗30質粒DNA的酶切及電泳160
實驗31DNA片段的回收162
實驗32DNA片段的連接164
實驗33感受態細菌的制備166
實驗34重組DNA的轉化與篩選167
實驗35外源基因在大腸桿菌中的誘導表達170
實驗36常規PCR171
實驗37逆轉錄-聚合酶鏈反應173
實驗38實時定量PCR176
實驗39DNA的分子雜交——Southern印跡178
實驗40RNA的分子雜交——Northern印跡182
實驗41蛋白質的免疫印跡——Western印跡185
實驗42cDNA文庫的構建187
實驗43熒光素酶報告基因檢測啟動子活性192
實驗44電泳遷移阻滯實驗195
實驗45染色質免疫沉淀實驗201
實驗46酵母雙雜交實驗205
實驗47RNA干擾實驗210
實驗48蛋白質免疫共沉淀實驗216
實驗49RNA免疫共沉淀實驗218
實驗50GSTpull-down實驗220
附錄222
附錄1化學試劑分級與注意事項222
附錄2常用緩沖液的配制223
附錄3硫酸銨飽和度計算表229
附錄4常用培養基及抗生素的配制231
附錄5離心機轉速（r/min）與相對
離心力（RCF）的換算234
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生物化學與分子生物學實驗教程(第2版) 節選
**篇 生物化學與分子生物學實驗基本知識與理論 **章 生物化學與分子生物學實驗基本知識 一、實驗室基本規則 為了保證生物化學與分子生物學實驗的順利進行，培養同學們掌握良好、規范的生物化學與分子生物學基本實驗技能，特制定以下實驗細則，請同學們嚴格遵守。 （1）課前認真預習，熟悉本次實驗的目的、原理、操作步驟，了解每一操作的意義，了解所用儀器的使用方法，做好實驗設計。 （2）嚴格按照生物化學與分子生物學實驗分組，分批進入實驗室，不得無故遲到。學生須提前10min到實驗室，任課教師提前15min到崗。 （3）進入實驗室應穿工作服，不必要的物品不得帶入實驗室，必須帶入的書籍和文具等應放在指定的非操作區，以免受到污染。無菌操作時應按規定戴口罩和手套。 （4）按規定分組進入實驗室，應保持安靜，實驗室內禁止飲食、抽煙，不得大聲喧嘩和嬉戲，不得隨意走動，將手機關閉或置于靜音狀態。絕對禁止用實驗儀器或試劑開玩笑。 （5）應保持實驗臺的整潔，儀器、試劑擺放整齊，用過的濾紙、手套和EP管等一次性物品放入垃圾桶中，廢液倒入廢液缸中，禁止直接倒入水槽中或隨地亂丟。 （6）要精心使用和愛護儀器，洗滌和使用儀器時，應小心仔細，防止損壞儀器。使用貴重精密儀器前應了解使用方法，使用時要嚴格遵守操作規程，發現故障立即報告教師，不得擅自移動或動手檢修實驗儀器。例如，使用分光光度計時，不能將比色杯直接置于分光光度計上，并注意拿、放比色杯時，不要打碎。儀器損壞時，應如實向教師報告，并填寫儀器損壞登記表，然后補領。 （7）注意節約試劑，公用試劑用完后，應立即蓋嚴放回原處。勿使試劑、藥品灑在實驗臺或地上。 （8）在實驗過程中，聽從老師指導，嚴格按操作規程進行，完成實驗后按要求及時書寫實驗報告，并把實驗結果和數據及時、如實記錄在實驗記錄本上，實驗報告要真實，文字要簡練、準確。若實驗失敗，應及時分析原因。 （9）實驗教學區內嚴禁吸煙，禁用明火；乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加熱，并要遠離火源操作和放置。 （10）注意節約用水用電，離開實驗室前要關好水源、電源，關好門窗，嚴防事故發生。 （11）實驗室內一切物品，未經本室負責教師批準，嚴禁帶出室外，借物必須辦理登記手續。 （12）做完實驗要清洗儀器、器皿，每次實驗課由班長或課代表負責安排值日生。值日生的職責是負責當天實驗室的衛生、安全和一切服務性的工作。 （曾益軍） 二、實驗室基本操作 （一）器皿儀器的清洗 1. 玻璃器皿的清洗在生物化學與分子生物學實驗中，所用的玻璃儀器清潔與否，直接影響實驗的結果，往往由于儀器的不清潔或被污染而造成較大的實驗誤差，有時甚至會導致實驗的失敗。生物化學與分子生物學實驗對玻璃儀器清潔程度的要求，比一般化學實驗的要求更高。這是因為：①生物化學與分子生物學實驗中蛋白質、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”計，稍有雜質，影響就很大。②生物化學與分子生物學實驗對許多常見的污染雜質十分敏感，如金屬離子（鈣、鎂等）、去污劑等，因此玻璃儀器（包括離心管等塑料器皿）潔凈與否，是獲得準確結果的重要前提。潔凈的玻璃儀器內壁應十分明亮光潔，無水珠附著在玻璃壁上。 （1）*用玻璃儀器的清洗：新購買的玻璃儀器表面常附著有堿性物質，同時常有許多灰塵附在上面，使用前必須徹底清洗。先用洗滌靈稀釋液、肥皂水或去污粉等洗刷，用自來水洗凈，然后浸泡在1%～2%鹽酸溶液中過夜（不少于4h），以中和其堿性物質，再用自來水沖洗，*后用蒸餾水沖洗3次，80℃烘箱烤干備用。 （2）使用過的玻璃儀器的清洗 1）一般玻璃儀器，如試管、燒杯、錐形瓶等，先用自來水洗刷去凈污物，再用大小合適的毛刷蘸取洗衣粉、合成洗滌劑或去污粉仔細刷洗器皿內外壁，自來水多次反復沖洗至容器內壁不掛水珠，*后用少量蒸餾水洗2～3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干備用。 2）容量分析儀器，如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后應及時用自來水多次沖洗，細心檢查潔凈程度，根據掛不掛水珠采取不同處理方法：①如不掛水珠，用蒸餾水沖洗3次，風干備用；②若沖洗后的器皿仍掛水珠，則將其晾干后，用重鉻酸鉀洗液浸泡4～6h，再用自來水沖洗，*后用蒸餾水洗3次控干。 3）石英和玻璃比色皿的清洗：決不可用強堿清洗，因為強堿會侵蝕拋光的比色皿，需用洗液或1%～2%的去污劑浸泡后用清水沖洗，然后使用綢布包裹的小棒或棉花球棒刷洗，效果會更好。潔凈的比色皿應內外壁均不掛水珠。 2. 塑料器皿的清洗聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿已在生物化學與分子生物學實驗中廣泛使用。初次使用塑料器皿時，可先用8mol/L尿素（用濃鹽酸調pH=1）清洗，接著依次用無離子水、1mol/L KOH和無離子水清洗，然后用10?3 mol/L EDTA除去金屬離子的污染，*后用無離子水徹底清洗，以后每次使用時，可只用0.5%的去污劑清洗，然后用自來水和無離子水洗凈即可。 3. 黏附有血漿的刻度吸量管常用的三種洗滌方法 （1）先用45%尿素溶液浸泡，使血漿蛋白溶解，然后用自來水沖洗。 （2）用1%氨水浸泡，使血漿溶解，然后再依次用1%稀鹽酸溶液、自來水沖洗。 （3）以上兩種方法如達不到清潔要求，可浸泡于重鉻酸鉀洗液4～6h，再用大量自來水沖洗，*后用蒸餾水沖洗2～3次。 4. 其他盛過傳染性樣品的容器，應進行高壓或其他方法消毒。盛過有毒藥品、放射性同位素試劑的容器，必須經過專門處理，確知沒有殘余物存在方可進行清洗。凡用過的玻璃儀器，均應立即洗滌，久置干涸后洗滌十分困難。如不能及時洗滌，先用流水初步沖洗后浸泡在清水中，待實驗后按常規處理。 5. 洗滌液的種類和配制方法 （1）重鉻酸鉀洗液（以下簡稱洗液）的配制及注意事項 1）洗液的配制：洗液可配制成三種不同的強度，其成分用量見表1-1-1。 配制洗液時先將重鉻酸鉀溶于蒸餾水中，必要時可加熱幫助溶解，待冷卻后再將濃硫酸緩慢加入，邊加邊攪拌。注意此時可產生高熱。為防止容器破裂，應選用耐酸搪瓷缸或耐高溫的玻璃器皿，切忌用量筒及試劑瓶等配制。為防止洗液吸收空氣中的水分而被稀釋變質，洗液應儲存于帶蓋的容器中。一般*常用的為次強液。 表1-1-1 鉻酸洗液的配制 2）使用時應注意以下幾點：①需用洗液浸泡的容器，在浸泡前應盡量瀝干，否則會因洗液被稀釋而降低洗液氧化力。②Hg2+、Ba2+、Pb2+ 等可與洗液發生化學反應，生成不溶性化合物沉積在容器壁上。因此，凡接觸過上述離子的容器，應先除去上述離子（可用稀硝酸或5%～10% EDTA清除）。③油類、有機溶劑等有機化合物可使洗液還原失效。因此，容器壁上附有大量油類、有機溶劑時應先去除。④洗液的酸性和氧化性很強，使用時應格外注意，千萬不要滴落在皮膚或衣物上，以免灼傷或燒壞。⑤洗液顏色由深棕色變為綠色時，說明洗液已經失效，應停止使用，更換新液，因重鉻酸變成硫酸鉻后不再具有氧化能力。 （2）其他洗滌液 1）工業濃鹽酸：可洗去水垢或某些無機鹽沉淀。 2）5%草酸溶液：用數滴硫酸酸化，可洗去高錳酸鉀的痕跡。 3）5%～10%磷酸三鈉（Na3PO4 12H2O）溶液：可洗滌油污物。 4）30%硝酸溶液：洗滌二氧化碳測定儀及微量滴管。 5）5%～10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）溶液：加熱煮沸可洗脫玻璃儀器內壁的白色沉淀物。 6）尿素洗滌液：為蛋白質的良好溶劑，適用于洗滌盛過蛋白質制劑及血樣的容器。 7）有機溶劑：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脫油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脫油漆的污垢。 8）氫氧化鉀的乙醇溶液和含有高錳酸鉀的氫氧化鈉溶液：這是兩種強堿性的洗滌液，對玻璃儀器的侵蝕性很強，可清除容器內壁污垢，洗滌時間不宜過長，使用時應小心慎重。 6. 玻璃和塑料器皿的干燥通常使用烘箱或烘干機進行干燥，而不要用丙酮蕩洗再吹干的方法來干燥，因為那樣會有殘留的有機物覆蓋在器皿的內表面，從而干擾實驗結果。 （二）吸量管和微量移液器的使用 1. 吸量管的種類及使用方法 （1）刻度吸量管 1）刻度吸量管的種類：①按容量規格來分，有0.1ml、0.2ml、0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml、10ml等數種。其精密度按不同的容積可達移取量的0.1%～1%。通常將管身標明的總容量分刻為100等分。因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml，其余類推。②按“0”點位置來分，有“0”點在吸量管上端的（即讀數從上而下逐漸增大），也有“0”點在吸量管下端的（讀數從下而上逐漸增大）。兩種標示方法，在使用時各有方便之處。③按刻度方法來分，刻度吸量管也有兩種，一種是刻度刻到尖端的，將液體放出時，應吹出殘留在吸量管尖端的少量液體，另一種是刻度不刻到尖端的。 2）刻度吸量管的正確使用方法：在吸取液體時，*先認清試劑標簽，選擇容量大小合適的吸量管，用右手拇指和中指拿住吸量管上端，將吸量管的尖端伸入待取液體的液面下約1cm處，左手持洗耳球對準吸量管上口，輕輕吸取，使液體從吸管下端徐徐上升，當液面升到刻度以上時，移去洗耳球，迅速用右手食指按緊吸量管的上口，以控制試劑的泄放。將吸管下端提離液面并接觸瓶頸內壁，吸液后應盡量使吸量管保持垂直，此時視線平視吸管刻度標線，稍松抬右手食指或輕輕轉動吸量管，液面即緩緩下降。待液體彎月面的*低點與吸量管的刻度相切時，立即按緊食指，使液體不再流出，將吸量管移入準備接收試劑的容器中，其尖端接觸容器內壁，松開右手食指使液體自然流出，待液體流完后再等15s，捻動一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，則吹出尖端的液體后再捻轉一下吸量管移去）。 3）使用刻度吸量管的注意事項：①選擇適當規格的吸量管，吸量管的*大容積應等于或略大于所需容積（ml）；②仔細看清吸量管的刻度情況，弄清刻度是否包括吸量管尖端的液體，讀數方向是自上而下，還是自下而上；③拿吸量管時，刻度一定要面向自己，以便讀數；④吸取試劑時應注意三點：一是先吹去吸量管內可能存在的殘留液體，二是將吸量管插入試劑液面深部（以免吸液過程中因液面降低而吸入空氣產生氣泡或管內試劑進入洗耳球），三是使用洗耳球（不可直接用口吸）；⑤按吸量管上口時通常用食指；⑥吸取黏滯性大的液體（如血液、血漿、血清等）時，除選用合適的吸管外，應注意拭凈管尖附著的液體，盡量減慢放液速度，待液體流盡后吹出管尖殘留的*后一滴液體；⑦使用的吸量管應干凈、干燥無水。如急用而又有水時，可用少量欲取試劑沖洗3次，以免試劑被稀釋。 （2）移液吸量管：常用量取50ml、25ml、10ml、5ml、2ml、1ml的液體，常見的一種是吸量管的上端只有一個刻度，另一種是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狹窄處也有一刻度線。無論哪一種，在使用時將量取的液體自然流出后，只需將吸量管的尖端觸及受器壁約半分鐘即可，不得吹出尖端殘留的液體。 （3）奧氏吸量管：供準確量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml液體所用。這種吸量管只有一個刻度，當放出所量取的液體時，管尖余留的液體必須吹入容器內。 （4）使用原則：量取整數量液體，并且取量要求準確時，應該選用奧氏吸量管。量取大體積時要用移液吸量管。同一定量實驗中，如欲加同種試劑于不同的管中，并且取量不多時，應選擇一支與*大取液量接近的刻度吸量管。 2. 定量吸（移）液器（微量加樣器） （1）定量吸液器的優點：使用方便，取、加樣迅速，計量準確，不易破損，能吸取多種樣品（只換吸頭即可）。<
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